㊃基础研究㊃
基金项目：北京市教育委员会科学研究与研究生培养共建项目(2016)，国家自然科学基金面上资助项目(81573927)
作者单位:100700 北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室 北京市重点实验室[巩卓彦(硕士研究
生)㊁黄帅阳(硕士研究生)㊁刘珍洪(博士研究生)㊁秦高凤(博士研究生)㊁王蓬文]；江苏省中西医结合医院(吴艺琼)
作者简介：巩卓彦(1994-)，女,2018级在读硕士研究生㊂研究方向：神经变性病的中医药防治㊂E⁃mail:gongzhuoyan629@163 通信作者：王蓬文(1963-)，女，博士，教授，博士生导师㊂研究方向：神经变性病的中医药防治㊂E⁃mail:pw_
wang@163
基于突触和突触蛋白探讨复方金思维对拟散发性阿尔茨海默病小鼠早期突触传递和功能的影响 巩卓彦 吴艺琼 黄帅阳 刘珍洪 秦高凤 王蓬文
【摘要】 目的 通过观察复方金思维干预后拟散发性阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)小鼠海马突触形态以及α7尼古丁乙酰胆碱受体(α7⁃nicotinic acetylcholine receptors,α7⁃nAChRs)和代谢性谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptors 5,mGluR5)两种突触相关蛋白的变化，探讨复方金思维对拟散发性AD 小鼠早期学习记忆的影响㊂方法 将3月龄C57/BL6J 小鼠随机分为对照组㊁模型组㊁多奈哌齐组[0.92mg /(kg㊃d)]及复方金思维大㊁中㊁小剂量组[20mg /(kg㊃d),
10mg /(kg㊃d),5mg /(kg㊃d)]，对照组双侧侧脑室注射人工脑脊液，其余各组小鼠双侧侧脑室注射链脲佐菌素建立散发性AD 模型，造模1个月后连续灌胃3个月，进行Morris 水迷宫行为检测，之后取小鼠海马对其CA1区突触进行超微结构观察，并采用免疫组织化学和Western blot 技术对海马CA1区α7⁃nAChRs 和mGluR5分布和表达进行检测㊂结果 Morris 水迷宫结果显示，随着训练次数的增加每组小鼠定向航行潜伏期均缩短㊂电镜结果显示，与模型组相比，各干预组小鼠突触超微结构均有一定程度改善㊂免疫组化结果显示，与模型组比较，多奈哌齐组和复方金思维大剂量组α7⁃nAChRs 的阳性细胞数均有所增加(P <0.05)，多奈哌齐组及复方金思维大㊁中剂量组mGluR5的阳性细胞数均有所减少(P <0.01或P <0.05);Western⁃blot 检测mGluR5结果与免疫组化结果一致㊂结论 复方金思维可能通过改善拟散发性AD 小鼠海马CA1区突触结构，调节突触相关蛋白α7⁃nAChRs 和mGluR5表达起到早期神经保护作用，进而提高其学习记忆能力㊂ 【关键词】 阿尔茨海默病; 复方金思维; 突触; α7尼古丁乙酰胆碱受体; 代谢性谷氨酸受体5;
散发性AD 小鼠
中国和声【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2021.01.004Discussion on effects of compound Jinsiwei on early synaptic transmission and function in mice with sporadic AD based on synaptic and its proteins
GONG Zhuoyan ,WU Yiqiong ,HUANG Shuaiyang ,LIU Zhenhong ,QIN Gaofeng ,WANG Pengwen Ministry of Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine ,Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medince ;Key Laboratory of Beijing City ,Beijing 100700,China Corresponding author :WANG Pengwen ,Email :pw_wang@163
【Abstract 】 Objective To explore effects of Compound Jinsiwei on early learning and memory in mice with sporadic Alzheimer ’s disease (AD ),by observing the changes of synaptic morphology in
hippocampus andα7nicotinic acetylcholine receptors(α7⁃nAChRs)and metabolic glutamate receptor5 (mGluR5)in AD mice after intervention with compound Jinsiwei.Methods The3⁃month⁃old C57/BL6J mice were divided into6groups,including control group,model group,donepizil group(0.92mg㊃kg-1㊃d-1),low,medium and high dose of compound Jinsiwei groups(20mg㊃kg-1㊃d-1,10mg㊃kg-1㊃d-1 and5mg㊃kg-1㊃d-1reapectively).In the control group,bilateral lateral ventricles were injected with art
ificial cerebrospinal fluid,and bilateral lateral ventricles were injected with STZ in the rest groups to establish mice model with sporadic AD.After one month of modeling,continuous gavage for3months were performed,then the mice’s behavior was detected by Morris water maze teset.After that,the hippocampus of mice were taken to observe synapse’s ultrastructure in CA1region.The distribution and expression of α7⁃nAChRs and mGluR5in in CA1region of hippocampus were detected by by immunohistochemistry and Western blot.Results The Morris water maze results showed that the directional navigation latency of each group decreased with the increase of training times.The results of electron microscopy showed that the synaptic ultrastructure of mice in each intervention group was improved to some extent compared with the model group.Immunohistochemical results showed that,compared with the model group,the number of positive cells ofα7⁃nAChRs increased in both donepezil group and high dose of compound Jinsiwei group (P<0.05),while the number of positive cells of mGluR5in donepezil group and high and medium dose of compound Jinsiwei all decreased(P<0.01or P<0.05).Western blot results of mGluR5were consistent with immunohistochemical results.Immunohistochemical results showed that compared with the control group,the number of positive cells in the hippocampal CA1region ofα7⁃nAChRs decreased significantly and the number of positive cells in mGluR5increased significantly(P<0.01).Compared with the model group,the number of positive cells ofα7⁃nAChRs in both the donepezil group and Chi
nese medicine compound Jinsiwei high dose group increased(P<0.05),and the number of positive cells of mGluR5in both the Chinese medicine compound Jinsiwei high dose group and middle dose group decreased(P<0.01 or P<0.05).The consequences of western⁃blot analysis of mGluR5were consistent with the immunohistochemical results.Conclusion Compound Jinsiwei may play an early neuroprotective role,by improving the synapses’s structure in hippocampus CA1region of sporadic AD mice and regulating the ex⁃pression of synapse associated proteinsα7⁃nAChRs and mGluR5,thus improving their learning and memory ability.
假如我是一个病人
路桥年票【Key words】 Alzheimer’s disease; Compound Jinsiwei; Synapse; α7nicotinic acetylcholine receptor; Metabolic glutamate receptor5; Sporadic AD mice
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)起病隐匿并呈进行性发展趋势，主要临床表现为认知㊁生活及行为功能障碍，病变累及多个系统㊂突触信号传递蛋白在神经信号的正常传递方面起到重要影响作用，其功能的缺失会进一步改变认知能力[1]㊂AD所发生的某些病理改变与谷氨酸受体缺陷有关[2]，其亚型代谢性谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptors5,mGluR5)是突触后膜介导Aβ寡聚体(A beta oligomers,Aβo)产生细胞毒性，破坏突触正常传递功能并产生认知障碍的必要受体蛋白㊂研究胆碱能信号蛋白在突触中的变化可以帮助进一步认识AD[3]㊂烟碱型乙酰胆碱受体家族中的α7尼古丁乙酰胆碱受体(α7⁃nicotinic acetylcholine receptors,α7⁃nAChRs)位于突触前膜和后膜，前膜的α7⁃nAChR
s 调控释放神经递质，后膜的α7⁃nAChRs在包括主导学习记忆功能的海马在内的多个脑区域调控突触可
塑性㊂突触是AD病理变化出现的最早部位，在Aβ
影响下其功能发生了改变，研究突触的改变不仅能够
认识早期AD病理变化，而且可以帮助寻AD
的有效靶标㊂奥巴马会见喇嘛
中药复方金思维是一种自草药提取的混合
物，由田金洲教授研究团队在中国工程院院士王
永炎教授指导下研制而成，其中包括由人参中的
人参皂苷，来自菖蒲的细辛醇，远志的细叶远志皂
苷，来自淫羊藿的黄酮苷，郁金中的姜黄素等八种
有效成分[4⁃5]㊂轻度认知功能障碍是AD前认知功能的中间状态，中药复方金思维能够显著改善遗
忘型轻度认知功能障碍患者的认知功能[6]；研究发现中药复方金思维能通过抑制APPV717I小鼠脑内早老素1活性和促进胰岛素降解酶和脑啡肽
酶活性来降低Aβ水平[7]；有研究发现中药复方金思维能通过增加AD模型大鼠海马区GAP⁃43表达影响突触可塑性[8]㊂然而，尚不清楚早期突触传递和突触功能障碍在中药复方金思维改善早期认知损害中是否发挥重要作用，因此研究旨在通过观察中药复方金思维干预下拟散发性AD小鼠脑内突触蛋白α7⁃nAChRs和mGluR5的表达变化，探讨中药复方金思维对AD病理变化中突触传递和功能的影响㊂
1 材料与方法
1.1 试剂及设备
复方金思维为专利制剂[9](专利号:2008100067330) (药物组成：人参㊁肉苁蓉㊁地黄㊁茯苓㊁石菖蒲㊁郁金㊁丹参和远志)，由北京中医药大学东直门医院药房制备；盐酸多奈哌齐购自卫材(中国)药品有限公司，药品批号:140625；羟甲基纤维素钠由北京精求化工有限公司提供，批号:3405005;2.5%戊二醛和0.1MPB缓冲液购自北京陆军总医院；叔戊醇和多聚甲醛由北京化学试剂公司提供；一抗兔抗小鼠α7⁃AchR抗体(免疫组化抗体滴度1∶200)和mGluR5抗体(免疫组化抗体滴度1∶500,Western blot抗体滴度1∶7500)由Abcam公司提供; Western⁃blot所用RIPA裂解液，批号:R0010;1M㊁1.5M Tris⁃HCL缓冲液，批号:A1010,T1020;SDS溶液,SDS⁃PAGE凝胶配置试剂盒，链脲佐菌素(Sigma)均由北京索莱
宝科技有限公司提供；免疫组化所用柠檬酸盐，货号:ZLI:9064,RT;PBS缓冲液粉剂，货号:9061；兔二步法试剂盒，货号: PV⁃9001；小鼠二步法试剂盒，货号:PV⁃9002，均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;Morris水迷宫测试及相关分析仪器购自上海移数信息科技有限公司;JEM⁃2100F型透射电镜来自日本日立电子公司㊂
1.2 动物
实验动物来自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号(京):2012⁃0001]㊂雄性3月龄C57/BL6J小鼠，共计90只㊂由北京中医药大学东直门医院屏障环境动物室[实验动物使用许可证号(京):2015⁃0001]负责饲养，每日按时灌胃，小鼠自由饮水进食，定期更换垫料㊂本研究所用实验动物经由北京中医药大学东直门医院动物伦理委员会准许(伦理编号:16⁃13)㊂1.3 动物分组及给药
将90只C57/BL6J小鼠随机分为6组(每组15只)：对照组㊁模型组㊁多奈哌齐组[0.92mg/(kg㊃d)]及复方金思维大㊁中㊁小剂量组[20mg/(kg㊃d),
10mg/(kg㊃d),5mg/(kg㊃d)]㊂第1和第3天进行双侧侧脑室造模：用叔戊醇对小鼠进行麻醉，剪掉头顶上的毛发并用酒精消毒，沿中线剪开小鼠头皮并暴露前囟，以前囟旁侧1.0mm和后侧0.3mm 为坐标，向下进针2.5mm，利用微量注射器注入3μL液体㊂除对照组其余5组小鼠按照3mg/kg浓度注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)，对照组小鼠按照相同方法双侧侧脑室注射等量生理盐水[10⁃12]㊂造模1个月
后给药，每日定时灌胃，持续3个月㊂1.4 Morris水迷宫测试
Morris水迷宫实验中，第1天和第2天为训练阶段，第3天至第5天为测试阶段，本次实验旨在测试小鼠在训练阶段定位航行潜伏期的时间㊂
1.5 透视电镜观察
Morris水迷宫实验结束，对小鼠(3只/组)进行灌注固定，断颈，在冰上迅速剥离海马，用2.5%戊二醛溶液进行固定,4℃静置2小时，用PBS缓冲液冲洗3次㊂将海马组织制成超薄切片，在×7000倍数视野下观察小鼠海马CA1区突触超微结构，并对突触的形态学变化进行分析㊂
1.6 Western blot检测
Morris水迷宫实验结束，对小鼠(6只/组)进行麻醉并进行断颈处死，迅速取出海马并置于EP管中并在液氮罐中保存㊂对组织进行蛋白提取并对其浓度进行测定；配胶并上样；电泳跑浓缩胶时用60V，使样品压成一条线，跑到分离胶以后用120V 跑，根据所要检测的蛋白分子量大小来决定最终电泳停止的时间；转膜后进行杂交，做杂交前应先进行膜封闭，然后进行抗体孵育；使用HRP⁃ECL发光法进行发光鉴定；用Hp Scanjet G4050仪器进行扫描并保存为TIF格式，并基于Image J㊁Excel软件对其进行分析，得到相对百分数结果，基于Prism软件制作柱状图进一步说明结果数据㊂
1.7 免疫组化检测
Morris水迷宫实验结束，对小鼠(6只/组)进行灌注固定，断颈处死，迅速脑组织用多聚甲醛固定液进行固定，石蜡包埋后从冠状面切成4m m薄片，接着进行烤片㊁脱蜡㊁消除内源性过氧化物酶㊁抗原修复㊁抗体孵育㊁显㊁脱水㊁封片，最后每组
选6张切片在×20倍显微镜视野下观察海马CA1区α7⁃nAChRs和mGluR5阳性细胞，并利用Image⁃
pro Plus软件进行分析㊂
1.8 统计学处理
数据结果通过SPSS20.0进行分析，数据符合正态分布，使用均数±标准差(x±s)表示;Morris水迷宫实验潜伏期数据为重复测量数据，符合球形检验，采用重复测量方差分析;α7⁃nAChRs和mGluR5蛋白均重复检测3次，实验数据均呈正态分布且方差齐，运用单因素方差分析(One⁃way ANOVA)，通过LSD检验进行组间比较㊂P<0.05表明结果有统计学意义㊂
2 结果
2.1 复方金思维对小鼠定位航行潜伏期的影响
实验结果显示，随着训练次数的增加每组小鼠定向航行潜伏期均缩短，具体表现如下：实验期间，与对照组比较，模型组潜伏期明显增加(P<0.01)；与模型组相比较，第四天，多奈哌齐组和复方金思维小剂量组潜伏期均缩短(P<0.01或P<0.05)；第五天，与模型组相比，多奈哌齐组和金思维各剂量组潜伏期均减短(P<0.01或P<0.05)㊂结果见表1㊂
2.2 复方金思维对小鼠突触结构的影响
电镜×7000倍视野下观察小鼠突触超微结构，结果显示：对照组突触结构正常且清晰，突触前膜有大量球形突触小泡，可见清晰的线粒体，突触间隙宽度及形态正常，突触后膜厚度正常且均匀(图1A)；模型组突触形态结构不完整，突触内线粒体结构不清晰，突触小泡分布零散且形态模糊(图1B)；多奈哌齐组突触结构清晰，前膜和后膜形态正常，可见较为清晰的线粒体结构，突触间隙宽度正常(图1C)；复方金思维各药物组突触形态及结构均基本正常，其中中剂量组可见结构完整且清晰的线粒体，小剂量组突触前膜可见大量清晰的突触小泡聚集，各组突触间隙均宽度及形态正常(图1D⁃F)㊂结果见图1㊂
2.3 小鼠海马CA1区α7⁃nAChRs和mGluR5阳性细胞数的变化
在×20倍显微镜视野下观察海马CA1区α7⁃nAChRs和mGluR5阳性细胞，实验结果显示:α7⁃nAChRs阳性细胞变化为：与对照组相比，模型组海马CA1区阳性细胞数表达显著减少(P<0.01)(图2A㊁2B)；与
模型组相比较，其他各药物组海马阳性细胞分布均较多(图2C⁃F)，多奈哌齐组和复方金思维大剂量组表达均有所增加(P<0.05)㊂mGluR5阳性细胞变化为：与对照组相比，模型组阳性细胞数表达显著增加(P<0.01)(图3A㊁3B)；与模型组相比较，其他各药物组海马阳性细胞分布较少(图3C⁃F)，多奈哌齐组，复方金思维大㊁中剂量组表达均有所减少(P<0.01或P<0.05)㊂综合上述结果，多奈哌齐组和复方金思维大剂量组与模型组比较，海马CA1区α7⁃nAChRs和mGluR5的阳性细胞数表达均有一定程度改善(P<0.05)㊂结果见图2，图3，表2㊂
表1 复方金思维对各组小鼠定位航行潜伏期的影响(s,x±s)
组别鼠只第一天第二天第三天第四天第五天对照组1596.16±15.7389.95±15.7280.33±27.3975.07±35.7471.93±38.79模型组15110.67±13.93a109.87±10.52a109.56±13.69a108.90±17.65a100.84±22.16a
多奈哌齐组15102.09±10.98102.02±11.2296.10±19.6684.60±31.34c75.27±43.36c 金思维大剂量组15103.91±18.06103.48±14.16101.35±26.04101.34±26.0386.74±48.38b 金思维中剂量组15103.75±13.62101.95±11.19101.30±16.48101.28±17.5379.06±41.17c 金思维小剂量组15105.25±10.13102.53±11.3196.10±14.2682.53±22.57c75.27±52.81c 注：与对照组相比a P<0.01；与模型组相比b P<0.05,c P<0.01㊂
注:A.对照组;B.模型组;C.多奈哌齐组;D.复方金思维大剂量组;E.复方金思维中剂量组;F.复方金思维小剂量组
图1 复方金思维对各组小鼠突触结构的影响(标尺=500μm)
注:A.对照组;B.模型组;C.多奈哌齐组;D.复方金思维大剂量组;E.复方金思维中剂量组;F.复方金思维小剂量组
图2 复方金思维对各组小鼠海马CA1区α7⁃nAChRs 阳性细胞分布影响(标尺=50m
m)
第六套广播体操注:A.对照组;B.模型组;C.多奈哌齐组;D.复方金思维大剂量组;E.复方金思维中剂量组;F.复方金思维小剂
量组
图3 复方金思维对各组小鼠海马CA1区mGluR5阳性细胞分布影响(标尺=50m m)
表2 复方金思维对各组小鼠海马CA1区α7⁃nAChRs
和mGluR5阳性细胞数表达的影响(x ±s )
组别鼠只α7⁃nAChRs 阳性细胞数(个)mGluR5阳性细胞数(个)对照组6140.17±24.9169.33±21.85模型组663.17±7.60a 123.33±24.94a 多奈哌齐组6114.83±20.27b 96.50±21.73b
金思维大剂量组6116.00±22.52b
93.50±9.60
c
金思维中剂量组6100.17±10.40101.50±10.65b 金思维小剂量组
6
81.17±5.53
114.83±16.14
注：与对照组比较,a P <0.01；与模型组比较,b P <0.05,c P <0.01㊂
2.4 通过Western⁃blot 实验观察小鼠海马CA1区mGluR5的变化
实验结果显示，与对照组比较，模型组海马
CA1区该蛋白的表达有所增加(P <0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组及复方金思维大㊁中剂量组小鼠海马CA1区该蛋白的表达均有一定程度减少(P <0.01或P <0.05)㊂结果见表3，图4㊂
表3 复方金思维对各组小鼠海马CA1区mGluR5
蛋白表达的影响(x ±s )
组别鼠只相对灰度值对照组661.33±21.85模型组6123.33±24.94a 多奈哌齐组696.50±21.73b
复方金思维大剂量组693.50±9.60c 复方金思维中剂量组6101.50±10.65b 复方金思维小剂量组
6
河姆渡人114.83±16.14
注：与对照组比较,a P <0.05；与模型组比较,b P <0.05,c P <0.
01㊂
注:A.对照组;B.模型组;C.多奈哌齐组;D.复方金思维大剂量组;E.复方金思维中剂量组;F.复方金思维小剂量组
图4 复方金思维对各组小鼠海马CA1区
mGluR5表达的影响
3 讨论
突触是神经元的特殊结构，神经递质从突触前轴突释放到突触间隙中，并激活突触后树突上的受体以传递信号[13]㊂随着AD 病情的发展，认知功能逐步恶化，突触丢失尤为突出，特别是在海马和皮层中㊂研究证明淀粉样蛋白如Aβ和tau 蛋白的沉积可能是导致AD 早期发病阶段出现突触衰竭的发病机制[14]㊂除此之外,AD 中突触丢失的机制还可能涉及轴突运输缺陷，氧化应激，线粒体损伤和神经炎症等[15]㊂在神经传递过程中，信号分子如谷氨酸㊁乙酰胆碱㊁多巴胺等从突触前神经元的活动区域释放出来，与突触后神经元的受体结合并激活受体㊂本实验重点讨论的突触蛋白α7⁃nAChRs 和mGluR5分别在神经信号传递中起重要作用[16]㊂尼古丁乙酰胆碱受体是调节学习和记忆功能的胆碱能信号重要介质[17]，尼古丁乙酰胆碱受体的激活会增加小胶质细胞对Aβ的吞噬作用，其亚型α7⁃
nAChRs 是调节兴奋性神经递质的重要蛋白，能够提高学习记忆能力[18]㊂α7⁃nAChRs 是一种配体门控离子通道受体，在细胞Ca 2+信号传导中起重要作
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