摘要
本研究以拟南芥作为模式系统，通过激活标记方法构建突变体库；进一步筛选抗病或感病的突变体，为克隆抗病基因以及抗病相关基因，研究植物与病原的互作机制，从而为进一步分子抗病育种打下基础。 本研究首先建立了适于花器浸蘸法转化拟南芥的栽培系统即平板打孔法，应用该栽培方法可以大量快速地转化拟南芥。进一步通过冻融法将包含有来自于花椰菜花叶病毒（ＣａＭＶ）３５Ｓ启动子的四个转录增强子和抗除草剂Ｂａｓｒａ的ｂａｒ基因序列ｐＳＫＩ１５质粒转入到农杆菌Ｇｖ３１０１中，转化的菌株经过重新提取质粒酶切验证和ＰＣＲ验证。然后通过农杆菌Ｇｖ３１０１的介导，成功地将包含有来自于花椰菜花叶病毒（ＣａＭＶ）３５Ｓ启动予的四个转录增强子和抗除草剂Ｂａｓｒａ的ｂａｒ基因序列转入到拟南芥中，通过喷施除草剂Ｂａｓｔａ来筛选突变体，共获得了约３８００株转化体，研究１０个转化体自交后代对除草剂Ｂａｓｔａ的抗性分离比，卡平方分析发现部分后代的分离比例分别符合３：ｌ，１５：１和６３：１的孟德尔遗传规律，因此，推断这些突变体分别是由一个、两个和三个拷贝的序列单独插入造成的。分离比为３：１的转化体占所检测总数的５／１０，分离比为１５：１的转化体占所检测总数的２／１０，分离比为６３：１的转化体占所检测总数的１／１０。另外有两个转化体的后代分离比分别为３６：５和７９：１５。
通过对突变体性状的观察共分离到多个叶片形状，株高或开花时间发生改变的突变体。
关键词：激活标记方法拟南芥突变体库
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｔａｇｇｉｎｇＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＭｕｔａｎｔｌｉｂｒａｒｙ
第一章绪论（文献综述）
第一节突变方法在拟南芥基因结构与功能研究上的应用概况中国人民解放军军事学院
黑箱法
通过诱发基因或ＤＮＡ片段中的特定核苷酸发生突变，使基因表达发生变化，是研究基因的作用，结构与功能分析研究上的最常用的方法之一。目前常用的三种突变方法有：辐射诱变方法，化学诱变方法和插入突变方法。 １辐射诱变方法和化学诱变方法在植物基因结构与功能研究Ｅ应用
ｓｔａｎｄｌｅｒ于１９２８年首次发现并证明ｘ射线和镭对禾谷类作物存在诱变效应（王琳清１９９４）。Ｌａｉｂａｃｈ等于４０年代成功地在拟南芥上做了第一个诱导实验，认为不同的诱变剂诱变效率不同，同一诱变剂对不同的基因诱变频率亦不同。６０－７０年代，通过化学诱变和辐射诱变等手段，创造出数百个拟南芥突变体，并研究其非整倍体的细胞遗传，在此基础上绘制出拟南芥的遗传连锁图谱。
ＬＩ辐射谤吏方法
Ｌ１．１辐射诱变的分类
第一类：电磁辐射诱变
同方真爱以电场和磁场交替振荡的方式穿过物质和空间而传递能量，本质上是一些电磁波，有能量，无静止质量。主要包括：Ｘ射线、Ｙ射线、激光和紫外线等。
第二类：离子辐射
一些组成物质的基本粒子，或是由这些基本粒子构成的原子，高速运动，通过损失自己的动能把能量传递给其它物质，既有能量，又有静止质量。主要包括ｎ、Ｂ粒子、质子、电子束和离子束等。
１．１．２辐射诱变的原理
辐射诱变利用能量高，穿透力强的射线，可以使原予的内层电子激活释放，致使原子呈离子化而与其它原子或分子结合，造成共价键断裂，形成染体结构变异，同时也可诱发一定的单基因突变。主要的遗传效应是：易位、倒位、缺失、移码突变和转换。１．２化擎谤变方法
ＯｅｈＩｋｅｒｓ（１９４３）最早在植物上利用化学物质诱发突变，用乌来糖（ｕｒｅｔｈａｎｅ脲脘）诱发月见草，百合等染体畸变。
化学诱变剂的种类很多，有近千种化学物质，按照诱变剂对ＤＮＡ分子作用的方式可分为四类。
第一类：烷化剂
有一个或多个活泼的烷基，能转移到其它电子密度较高的分子中，以烷基置换ＤＮＡ分子的氢原子，导致可以遗传的变异。常用的烷化剂有：甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）、硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、亚硝酸乙基尿烷（ＮＥＵ）、及乙烯亚胺（ＥＬ）等。
52se52se第二类碱基类似物以及相关化合物
在细胞内核酸复制时，碱基类似物可以掺＞－Ｎ新合成的ＤＮＡ分子中，且不妨碍ＤＮＡ的复制，然而由于碱基类似物在某些取代基上与正常的碱基不同，引起碱基配对错误。常用碱基类似物以及相关化合物的有：５一溴尿嘧啶（Ｂｕ）、８－氮鸟嘌呤、２一氨基嘌呤（ＡＰ）等。
生态环境学报第三类叠氮化合物
通过碱基替换，造成点突变。主要的叠氮化合物有：叠氮化钠（ＮａＮ３）等。
第四类其它种类的化学诱变剂
抗生素类如丝裂霉素，链霉素等，破坏ＤＮＡ，造成染体断裂；羟胺通过和ＤＮＡ的胞嘧啶作用，引起Ｇ．Ｃ到Ａ．Ｔ的转换，造成点突变；呀啶类如呀啶橙等，嵌入到相邻的碱基对之间，造成移码突变。
１．３糖理谤变和化学鼍变的比较
（１）辐射诱变，尤其是射线激发，常常导致缺失或染体重组，易产生真正的无效等位基因，可用于克隆控制某种表型的基因。
化学诱变可以导致高的突变率，但经常导致单个碱基的变化，而不是总的基因改变。单碱基对突变能导致所编码蛋白的单个氨基酸发生改变，是产生温敏型突变体的一种常用方法。
（２）化学诱变与辐射诱变相比，不利作用少，诱变效率高。
（３）辐射诱变作用迅速剧烈，在短时间内完成。
２
化学诱变有迟效作用，即化学诱变剂引起染体断裂，有的并不立即断开，而是在以后的分裂中再断裂；另外，还存在残留药物的后效作用。
（４）辐射诱变方法需要较为复杂的设备，成本比较高。
化学诱变方法虽然设备比辐射诱变方法有所简化，但是大多数化学诱变剂能致癌。２插入突变方法在植物基因结构与功能研究Ｅ应用
虽然化学诱变和辐射诱变方法构建突变体库比较容易，但是不容易寻多态性等标记，克隆基因需要花费的时间比较长，为便于克隆基因，发展了插入突变方法。常用插入突变方法包括：转座子标签法和Ｔ．ＤＮＡ标签法。
２．１转座予在植撕基因蛄构与功能分析上的应用
转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）最早由ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ３０年代在玉米中发现（ＭｃＣｌｉｎｔｏｅｋ，Ｂ．，１９５１），但转座子的概念直到】９６７年在大肠杆菌的半乳糖操纵子研究中发现插入序列这类转座子才被普遍承认和接受（朱乾浩，１９９６），并且直到１９８４年才应用转座子标签技术分离出第一个玉米ＵＤＰ．糖基转移酶基因（傅荣昭等。１９９４）。转座子标签技术在过去十几年中得到了广泛的应用。随着植物遗传转化方法日臻完善，已将玉米转座子Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｎ／Ｓｐｍ、或金鱼草转座因子Ｔａｍ３用于转化烟草（Ｂａｋｅｒ，Ｂ．等，１９８６：Ｐｅｒｅｉｒａ，Ａ．等，１９８９１ＭａｒｔａｉｎＣ．Ｒ，等，１９８９）、马铃薯（Ｋｎａｐｐ，ｓ．等，１９８８：Ｆｒｅｙ，Ｍ．等，１９８９）、番茄（Ｙｏｄｅｒ，Ｊ．Ｉ。等，１９８８）、拟南芥（ＶａｎＳｌｕｙｓ等，１９８７）、胡萝ｂ（ｖａｎＳｌｕｙｓ等，１９８７）、矮牵牛ｍａｒｉｎｇ等，１９８９），水稻（Ｍｕｒａｉ等，１９９１）、莴苣（Ｙａｎｇ等，１９９３）、亚麻（Ｆｉｎｎｅｇａｎ等，１９９３）、毛叶曼佗罗的单倍体（Ｔｈｉｌｏ等，１９９４）和百脉根（Ｔｈｙｋｊａｅｒ等，１９９５）等异源植物，并且通过Ａｃ／Ｄｓ，Ｓｐｍ／ｄＳｐｍ插入产生表型突变，通过转座子上的标记基因（如抗药性）就可以检测突变基因的位置和分离出突变基因，已先后分离到拟南芥，矮牵牛，烟草和番茄等异源植物上的有关基因。
２．１．１转座子插入突变的原理
转座子是可以从一个基因座位转移到另一个座位的ＤＮＡ片段，但原来位置的ＤＮＡ片段（转座子）并没消失，发生转移的只是转座予的复制品。基因发生转座最重要的遗传效应是引起插入突变。即当转座子插入到基因的外显子中时，使插入位置的基因失活并诱导产生突变型：或在插入位置产生新基因。
氰酸酯树脂
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