第37卷第3期高分子材料科学与工程Vol.37,No.3 2021年3月POLYMER MATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING Mar.2021
载Ce6的双敏感胶束嵌合到载DOX・HCl的温敏凝胶中 手拉手情系贫困小伙伴张攀峰】，甘子莹」，吴正中」，陈元维」，罗祥林12
(.四川大学高分子科学与工程学院；2.高分子材料工程国家重点实验室(四川大学)四川成都610065)
摘要：将双敏感胶束(PCL20-PDEA］5ss-PMPG2)包载疏水光敏剂(Cc6)，再将该胶束嵌入载有化疗药物盐酸阿霉素(DOX・HC1)的普朗尼克F-127水凝胶，制得胶束-温敏水凝胶双载药复合体系Cc6-miccllc/r)OX・HC1-G扫描电镜显示,Cc6-miiccllc成功嵌入水凝胶的层状结构中且呈分散均匀的颗粒。复合体系具有温敏性质，在37°C能快速转变为凝胶。体系中Cc6和DOX・HC1的释放及水凝胶的溶蚀符合零级动力学特征，药物累积释放对凝胶溶蚀量线性拟合较好。活性氧测定表明，660nm激光器辐照使Cc6-miccllc/DOX・HC1-G中的Cc6产生了单线态氧。细胞毒性测定显示，共培养的4T1癌细胞在受辐照的Cc6-miccllc/r)OX・HC1-G中细胞存活率最低，同时也明显低于没有辐照的情况。动物体内实验表明，采用肿瘤两侧给药的方式给药1次、并在给药后30min,6h,24h,48h用660nm的激光器辐照肿瘤,8d 后Cc6- miccllc/DOX・HC-G组的肿瘤大小不到空白组肿瘤大小的1/5。因此，Cc6-miccllc/DOX・HC-G具有实现光动与化疗联合肿瘤潜能。
关键词：pH/还原敏感胶束；温敏水凝胶；胶束-凝胶复合体系；肿瘤联合xp仿windows7主题包
中图分类号:TQ460.3文献标识码:A文章编号：10007555(2021)03016808
药物传送系统(Drug delivery systems,DDS)能提高药物的生物利用度、显著降低毒副作用，并能减少药物的使用剂量和给药频率，从而获得更好的效果。聚合物胶束就是一类具有独特壳核结构的DDS，对疏水药物具有增溶作用。由于其组成结构具有可调节性，从而使胶束尺寸可控制在需要的范围内。此外，因胶束壳层可接入特定的官能团，能实现靶向给药的目的。因此，聚合物胶束具有用作疏水药物的载体的独特优势。然而，聚合物胶束也有不足之处，如静脉注射载药胶束，能达到肿瘤部位的仅为百分之几；对水溶性的药物、生物分子(如蛋白质、核酸等)几乎无法实现包载⑵。
水凝胶用于传送水溶物和生物分子很有优势，可以保持水溶物和生物分子的活性。水凝胶中的温敏水凝胶，能够在生理温度附近发生溶胶-凝胶转变。利用这种特性，很容易在低温将药物溶解在温敏水凝胶中，将其注射到需要的部位，形成的凝胶可以作为持续供药的储库［3-4］。但水凝胶的亲水性质也同时限制了它对疏水药物或剂的传送［5］。使用水凝胶与其它DDS复合，可以克服水凝胶这一缺点。例如，将疏水性阿霉素和吲哚菁绿分别制成纳米粒，再将它们载入基质金属蛋白
酶响应水凝胶内，可获得纳米双载药智能水凝胶，实现光化协同［67］。有文献报道，可以将抗癌药物包载到胶束中，然后再将胶束与水凝胶复合，形成负载多种药物或剂的体系［8-9］。复合体系中的多种药物或剂相互之间不会发生干扰或反应，而且复合体系还可以弥补不同药物载体的缺陷，在药物传送中具有很大的应用潜能［10-11］…然而，在查到的文献中，几乎没有涉及到将敏感于肿瘤微环境的胶束与水凝胶复合的研究。
因此，本工作将双敏感胶束PCI.20-PDEA15-ss-
d()i：10.16865/jki.1000-7555.2021.0084
收稿日期:2020-09-14
基金项目：国家自然科学基金资助项目(51673129,51973130)
通讯联系人：罗祥林，主要从事生物医用高分子的合成与应用研究,E-mail：Luoxl_***********；
陈元维，主要从事生物医用高分子的合成与应用研究，E-mail：Chen *************
第3期张攀峰等：载Ce6的双敏感胶束嵌合到载DOX-HCl的温敏凝胶中用于肿瘤的光动与化疗联合169
PMPC12用于包载疏水光敏剂(Ce6)，再将该胶束嵌入载有化疗药物盐酸阿霉素(DOX-HCl)的普朗尼克F-27水凝胶中，制得胶束-温敏水凝胶双载药复合体系Ce6-micelle/DOX-HC-G。该体系可充分利用胶束和水凝胶的特点并克服各自的缺点，实现光动与化疗联合。研究工作主要包括探索Ce6-micelle/DOX-HC-G的凝胶性质、流变学性质，表征生物相容性、凝胶溶蚀及药物释放、光动性质，研究体内抗肿瘤情况。
1实验部分
1.1实验试剂
普朗尼克「127(99%)和盐酸阿霉素(DOX・HCl,98%)：购于Sigma-Aldrich；其余常用试剂：购于成都科龙化工试剂厂;PCl2)-PDEAi5-ss-PMPC2()：由本实验室合成［12］。
1.2复合体系的制备
1.2.1载药胶束(Ce6-micelle)的制备：将1mg Ce6和10m g PCI.2()-PDEA15-ss-PMPC2()溶解于2mL二甲亚砜和甲醇(体积比1:2)的混合溶剂中，以200“L/min的速度注射到6mL搅拌的蒸馏水中，注射后加入到透析袋中用超纯水透析72h。每8h换水1次，至完全除去有机溶剂，收取被透析溶液，定容为10mL，用450nm孔径滤头过滤，4°C保存。
1.2.2空白凝胶(Blank-G)的制备：将2g泊洛姆沙407(F-127)溶解在10mL蒸馏水中，于4C搅拌12 h完全溶解形成溶胶,F-127的质量分数是20%，于4 C保存。
1.2.3盐酸阿霉素凝胶(DOX•HC-G)的制备：先将盐酸阿霉素溶解于10mL蒸馏水中，然后将2gF-127加入到盐酸阿霉素的水溶液中，其余操作与制备Blank-G相同。
1.2.4Ce6胶束水凝胶(Ce6-micelle/G)的制备：将2
g F-127加入到10mL的Ce6胶束中，其余操作与制备Blank-G相同。
1.2.5Ce6胶束嵌合盐酸阿霉素水凝胶(Ce6-micelle/DOX•HC-G)的制备：先制备DOX-HC-G，再加入胶束溶液，使F-127的质量分数为20%。
1.3 测试与表征
1.3.1流变学表征：将样品放置于哈克旋转流变仪(ThermoFisher Scientific,MARS III)的测试平板上，在平板与椎体的中间形成一个直径25mm、厚度0.5mm的测试样品，液体石蜡密封锥体边缘，防止水分蒸发。测试采用温度扫描模式，固定频率1/s，以0.5C/min的速度从10C升温到45C。用试管倒转法测定胶束嵌合水凝胶的溶胶-凝胶转变。1.3.2外观形态表征：将水凝胶置于液氮中冷冻48 h，防止水凝胶内部结构坍塌。切取少许凝胶进行喷金处理，通过扫描电镜观察其表面形貌。
化维纤胶囊1.3.3体外药物释放和凝胶溶蚀：通过无膜溶出法考察水凝胶的溶蚀及药物释放行为。取1mL溶胶状态的样品置于10mL试管中，37C水浴5min使其充分成胶。沿试管壁小心加入提前预热到37C的释放介质PBS(pH=7.4) 1.5mL(小心操作避免破坏凝胶表面)，37C恒温水浴振荡。在设定的时间点取出全部释放介质置于离心管中，用释放介质定容至2mL，再用紫外分光光度计测定取出介质中DOX和Ce6浓度。将试管表面擦干，迅速称量记录，然后重新放入恒温水浴，再补充新鲜释放介质1.5mL。重复此操作，相邻时间点的试管质量差异即为水凝胶的溶蚀量。
1.3.4体外单线态氧的检测：采用二苯基异苯并咲喃(DPBF)作为活性氧(ROS)探针检测水凝胶的光动力性质。称取6m g DPBF加入2mL DMF，使其完全溶解，取15“L DPBF溶液分别加入到不同的样品溶液中，总体积为2mL。用660nm激光器对样品溶液进行光照，光照强度为0.2W/cm2，测定不同光照时间段内DPBF在415nm处的吸光度值。
1.3.5体外毒性评价：用MTT法测定水凝胶的细胞毒性。将小鼠乳腺癌细胞(4T1)以4000个/孔细胞密度接种于96孔板中，培养24h后移除培养基，加入75“L凝胶液，待成胶后，每孔加入75“L无血清培养基，继续培养6h，在避光条件下用660nm激光器(0.2W/cm2)照射各孔细胞，光照时间分别为0 min,10min。继续培养6h后，每孔加入15“L浓度为5mg/mL MTT溶液，孵育4h；除去上清液后每孔加入150“L DMSO，振荡15min，用酶标仪测定每个孔在490nm的吸光度。设置无细胞的空白培养基为对照组、不加材料的培养基为阴性对照组。细胞存活率(X)由式(1)计算
X=(OD\—ODQ/(OD b—ODQ(1)式中：OD「、OD…和ODb——分别是实验组、无细胞空白组和阴性对照组的平均吸光度组(”=5)。
1.3.6溶血实验：将大鼠的新鲜抗凝血于3500r/ min离心5min，取下层红细胞，用生理盐水洗涤，并配制成体积分数为8%的红细胞悬液；取270“L该
170高分子材料科学与工程2021 年
悬液与30 ptL 的空白凝胶、Ce6- micelle/
DOX ・HC-G 以及纯水(阳性对照)、生理盐水(阴性
对照)充分混合，在37 C 水浴孵育30 min 。将孵育 液以4000 r/min 离心5 min，小心取出上层清液，紫 外分光光度计测量上层清液在540 nm 的吸光度。 溶血率(HK )计算公式如式(2)
HR = (OD t - OD 0) / (OD b - OD 0)
(2.)
式中：OD ——实验组的吸光度；ODb ——阴性对照
组的吸光度;OD 0——阳性对照组的吸光度。
1.3.7 体内抗肿瘤实验：培养4T1细胞至对数成长 期，用胰酶消化，使用不含FBS 的RPMI 培养基配制 细胞密度为1 X 106 mL -1的4T1细胞悬液。对
BALB/C 小鼠(8〜20 g 、35〜56 d，雌性)用剃刀剃除
右侧腿部靠上的毛皮，将100 m l 均匀的细胞悬液接
种于预先设定的位置。当肿瘤体积达到50〜100
FOSmm 3时，将所有荷有4T1肿瘤的小鼠称量、标记后随
机分为4组(每组n = 5)，分别注射200 uL 的空白凝 胶、DOX ・ HC-G 、Ce6- micelle/G 和 Ce6- micelle/
DOX ・HCl-G o 给药方式是在肿瘤组织两侧各注射 100 uL 。其中药量按2. 0 mg/kg 的Ce6计算胶束
量，DOX ・HCl 的量是1. 5 mg/kg 。注射后分别在
30 min, 6 h,24 h, 48 h 用 660 nm 的激光器(200
mW/cm _2)距离肿瘤30 cm 照射瘤周围共15 min 。
小鼠开始给药的时间记为第0 d，在第1 d, 2 d, 4 d,
8 d 记录小鼠的体重、肿瘤大小。根据式V=0.5ab 2
计算肿瘤体积，式中：a 是肿瘤的最大直径；是肿瘤
的最小直径。
2结果与讨论
2.1凝胶的制备与表征
采用本实验室合成的pH/还原敏感聚合物
PCL 20-PDEA 15-ssPMPC 20将疏水光敏剂Ce6包载到
胶束中，再将胶束分散到载有化疗药物盐酸阿霉素的
F-127温敏凝胶中，形成复合系统(Fig.1)。复合凝
胶中的DOX ・HCl 可用于肿瘤的化疗，光敏剂Ce6
可用于肿瘤的局部光动力。这样的体系可以降 低化疗药物的使用剂量，大大降低药物的全身毒副作
用；而光敏剂被包载在胶束中可以克服其对皮肤的光 敏化作用。不仅如此，光动与化疗联合有可能产
生协同的效果，对肿瘤的将更具优势。
Fig.1 Scheme of the Ce6-micelle/DOX-G hydrogel
37°C
Black G DOXHC1-G Ce6-micelle/G Ce6-micelle/DOXHCl-G
Fig. 2 Shape of the gels at 4 °C and 37 °C
试管倒转法证明在37 C 形成了水凝胶(Fig. 2)。 扫描电镜显示了水凝胶的内部结构特征(Fig. 3)
。
第3期张攀峰等：载Ce6的双敏感胶束嵌合到载DOX ・HC1的温敏凝胶中用于肿瘤的光动与化疗联合171
所有冻干凝胶都呈层状结构。与空白凝胶或载盐酸 阿霉素的水凝胶片层不同，在Ce6-micelle/G 或Ce6-
micelle/DOX • HCl-G 凝胶孔洞的片层结构上有均
匀分散的胶束颗粒，因而证明复合体系是胶束嵌合到 水凝胶网络结构中形成的较均匀的状态。
Rtf
Black-G DOX HCl-G Ce6-micelle/G Ce6-micelle/DOX HCl-G
Fig. 3 SEM images of the gels
I
.mV
2.2水凝胶的流变学性质和血液相容性
随温度升高，所有水凝胶溶液的黏度在25 °C 附 近急剧增大，并在35~38 C 达到最大值(Fig. 4A)。
其中,Ce6-micelle/DOX ・HC-G 的凝胶转变温度大
约是27C 。盐酸阿霉素结构中存在羟基、羰基，能够 与泊洛姆沙中的羟基形成氢键，在凝胶化的过程中促
使凝胶形成，因而DOX ・HC-G 的胶凝温度略有下
降，体系黏度增大。而聚合物胶束的加入妨碍了
F-127分子间的相互作用，阻遏了凝胶化过程⑶，因
此,Ce6-micelle/G 胶凝化温度上升，体系黏度下降。 对于Ce6-micelle/DOX ・HC-G，既存在氢键形成的
促凝胶化作用，又存在胶束的妨碍凝胶化作用，两者 共同的作用使其比空白凝胶的胶凝温度略有升高，体 系黏度增大。
blank-G micelle-G DW
B
1O
0小20
£ 80尸40
米诺斯文明
20 25
30
35 40
t/°C
Fig.4 Rheological properties of the gels (A) and hemolytic properties (B)
■ ■ ■ ・^■ ■ o o o o o O 5 0 9 8 7 6 L 0 %'O Q R I S 一
saiouiuh
药物载体必定要接触生物体的血液，因而其血液 相容性是必须具备的性质。本实验室的前期工作发
现,PCL 20-PDEA 15-ss -PMPC 2胶束产生相当严重的
溶血，溶血率高达55%，是不能直接作为安全的药物 载体的。然而，该聚合物胶束具有良好的pH 敏感性 和还原敏感性，是肿瘤环境敏感的药物载体［3］。在
172高分子材料科学与工程2021 年
复合胶束凝胶体系中，胶束接触红细胞的几率大大降 低，并没有发生明显的溶血现象(Fig. 4B)。因而，复 合体系克服了胶束溶血的缺点，提高了体系的生物相 容性。
2.3胶束嵌合水凝胶载体的凝胶溶蚀和体外药物释
放
局部注射的水凝胶在生理环境中与体液直接接 触。因此，采用无膜溶出法考察水凝胶的体外药物释
放能更好地模拟药物的体内释药。
Fi g .5 显示的是 Ce6-micelle/DOX ・ HC-G 的中 Ce6和DOX ・ HCl 的累计释放量以及胶束嵌合水凝
胶的溶蚀率。药物释放行为及水凝胶的溶蚀符合零 级动力学特征，即DOX ・HCl 与Ce6的药物累积释
放量呈线性增长，但前者的斜率远高于后者。已有研 究表明，药物从原位凝胶的释放主要由药物的扩散及
载体的溶蚀决定［7］。F-127形成的温敏水凝胶也是一 种原位凝胶，将DOX ・ HCl 与Ce6的药物累积释放
对凝胶溶蚀量进行拟合，结果呈现较好的线性，表明
2种药物的释放都主要取决于凝胶的溶蚀，DOX ・
HCl 的释放速度远高于Ce6o 胶束中的Ce6的释放
有2种途径:Ce6先从胶束中释放出来，进入水凝胶,
然后随凝胶溶蚀释放出来；或者包载Ce6的胶束由
于凝胶溶蚀以胶束形式释放出来，再从胶束中释放出
Ce6o 从药物累积释放与凝胶溶蚀的相关性图可以
看出，水凝胶溶蚀率超过90%,Ce6的累计释放量在
200 min 内依然不足 20% (Fig. 5B 和 Fig. 50。因
此，Ce6-micelle/DOX ・HC-G 中Ce6的释放结果与
已有的研究结果一致［10］，主要是凝胶溶蚀释放出
李良铁
Ce6-micelle o 实际上，由于在肿瘤周围凝胶溶蚀，敏
感于肿瘤环境的Ce6-micelle 更容易被肿瘤细胞内
吞，在肿瘤细胞内发挥光热作用杀死肿瘤细胞。这样 的复合体系充分发挥了化疗药物快速、大量杀死原位 肿瘤细胞以及可能的转移肿瘤细胞，同时光动力
残留原位的肿瘤细胞。因此，该复合体系结合660
nm 近红外光辐照有可能产生更好的效果。
Fig.5 In vitro drug cumulative release and gel erosion rate
A : hydrogel erosion rate;
B ： drug cumulative release;
C ： correlation between drug cumulative release and gel erosion ；
D ： linear fitting equation
and fitness index
2.4体外单线态氧的检测DPBF 是一种单线态氧(ROS)的捕获剂，在
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