42解剖学研究2021 年第43 卷第 1期 Anat Res，2021，Vol.43, No.1
.论著•T h l相关细胞因子及金黄葡萄球菌定植诱导
许颖，禚风麟'
(首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心，北京100050)
【摘要】目的探讨颗粒物（PM)形成的有机化合物乙二醛加重特应性皮炎（AD)症状的分子机制。方法 选择40只雄性SD幼鼠为实验对象，于出生后第21天断奶，通过内皮下注射辣椒素构建AD模型，利用乙二醛蒸汽 循环装置对幼鼠进行乙二醛干预。根据实验要求，将40小鼠随机分为乙二醛AD组（Gly-AD组）、单纯AD组（Air-AD组）、单纯乙二醛组（Gly-naive组）和对照组（Air-naive组）。每周定期检测皮肤瘙痒和皮炎症状。采集大鼠皮 肤和血液，分析金黄葡萄球菌皮肤定植、抗菌肽和免疫球蛋白产生、炎性细胞因子mRNA表达等免疫学特征。结果①乙二醛可加重AD大鼠的瘙痒和皮炎，但未引起幼鼠的任何症状。②免疫荧光染显示，AD大鼠皮 肤表皮层中LL-37和P-defensin-2的表达显著高于幼鼠。与金葡菌定植结果相似，暴露于乙二醛后，AD和幼鼠表皮 中LL-37和(3-防御素-2的表达也明显升高。这表明抗菌肽表达的变化与乙二醛对金葡菌定植的增加有关。③乙 二醛暴露后，AD大鼠TNF-a和IFN-7mR NA表达显著升高，而幼鼠TNF-c t和丨FN-7 mRNA表达增加不明显。同时，暴露于乙二醛对A D和幼鼠IL-4和IL-5 mRNA的表达没有明显影响。且无论是AD大鼠还是幼鼠，暴露于乙二醛 后血清IgG2b及IgE水平均保持不变。这表明，暴露于乙二醛可上调AD大鼠皮肤中的T h l免疫反应，而对Th2免 疫反应无明M影响。结论在A D大鼠中，暴露于乙二醛加剧了皮肤瘙痒和炎症，这与金黄葡萄球菌在皮肤的 定植增加和T h l型免疫反应有关。
【关键词】特应性皮炎；乙二醛；颗粒物；金黄葡萄球菌；动物模型
rqThl related cytokines and Staphylococcus aureus colonization induce inflammation aggravation in atopic dermatitis rats XU Ying，ZHU Feng - lin. Laboratory Center，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China
Corresponding author ：ZHU Feng-lin , E-mail ：***********************
寻幸福 作文
【Abstract】Objective To investigate the molecular mechanism of the aggravation of AD symptoms by glyoxal, an organic compound formed by PM. Methods Young rats and AD rats were exposed to fresh air and evaporative glyoxal for 5 weeks (2h/d and 5dA^r) , respectively. The symptoms of pruritus and dermatitis were detected regularly every week. Skin and blood samples were collected to analyze the immunological characteristics of Staphylococcus aureus (S. aureus)colonization and i
nflammatory cytokines expression. Results (1)Glyoxal could aggravate the pruritus and dermatitis of AD rats , but did not cause any symptoms of young rats. (2)T he expression of LL-37 and p-defensin-2 in the epidermis of AD rats was significantly higher than that of young rats. Similar to the results of S. aureus colonization , the expressions of LL-37 and p-defensin-
2 in AD and immature mouse epidermis were significantly increased after exposure to glyoxal. (3) After glyoxal exposure,
the expression of TNF-a and IFN-7mRNA in AD rats was significantly increased, while that of young rats was not. At the same time, glyoxal exposure had no significant effect on the expression of IL-4 and IL-5 mRNA in AD and young rats. Serum IgG2b and IgE levels remained unchanged in AD rats and young rats after exposure to glyoxal. Conclusion In AD rats, glyoxal exposure aggravates skin itching and inflammation, which is related to the increased colonization of Staphylococcus aureus and Thl type immune response.
【Keywords】Atopic dermatitis; Glyoxal; Particulate matter; Staphylococcus aureus ; Animal model
基金项目：病原微生物生物安全国家_i：点实验室开放基金（SKLPBS1830)
1.首都医科大学附属北京友谊医院皮肤科，北京100050
通讯作者：糕风麟，E-mail:***********************
解剖学研究2021 年第 43 狯第 1 期 Anat Res，2021，Vol.43.1N«.143
特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD)是一种慢 性炎症性疾病，由免疫和环境因素的相互作用引 起。屏障功能障碍和Th2免疫反应构成了 AD启动的病理生理基础。因此，急性AD患者皮损的特 点是Th2细胞因子如IL-4和IL-5的显著升高1，而 在慢性AD皮损中，1型辅助性T细胞（Thl)免疫 反应与Th2免疫反应共存，而不是转向T hl为主的 炎症反应这些复杂的免疫反应可能归因于皮肤表面微生物谱系的改变、金黄葡萄球菌具 有定植AD患者皮肤的能力，并且经常在湿疹皮损 中发现 更重要的是，与健康人相比，AD患者皮损和非皮损皮肤中金葡菌的定植密度均显著 增加。这些变化的部分原因是AD患者中抗菌肽 的表达减少5:。此外，AD的异常免疫学特征对环 境刺激如空气污染物和过敏原有过度反应的倾 向6:。在环境因素中，空气污染物，包括挥发性有 机化合物（Volatile organic compounds，V0C)和颗粒 物（Particulate matter，P M)，受到越来越多的关注”。流行病学研究发现，V0C和PM不仅对AD 患者有加重作用，而且有助于AD的发生发展8。毒理学研究揭示了环境因素加重AD的免疫学特 征〇例如，尘螨变应原和甲醛可显著增加A D患者 和AD动物模型皮肤中TNF-ct和IL-1(3的mRNA表达。另一方面，苯及其代谢产物增加了产生IL-4 的Th2细胞的数量，减少了产生干扰素（IFN)g的T h l细胞的数量。然而，我们仍然缺乏对PM影响 AD表现的潜在机制的详细了解。因此，本研究探 讨PM是否在辣椒素诱导的AD动物模型中具有 促进病程进展的作用及PM恶化作用的潜
在分子 机制。
1材料与方法
1.1材料
1.I.1试剂和仪器 M-MLV逆转录酶（Invitgen，美国）、兔抗P-defensin-2多克隆抗体（Cloud-Clone公 司，美国）、兔抗LL-37多克隆抗体(Novus Biologies 公司，美国）、IgE ELISA试剂盒（CUSAB丨0，中国）、IgG2b EUSA试剂盒（Thermo Fisher Science，美国），等。
1.1.2实验动物、模型构建及分组SPF级SD大 鼠购自中国医学科学院医学实验动物研究所[SCXK(京）2019-0014]，所有动物均可自由饮用 自来水和颗粒饲料。在本实验室自然词养，允许妊娠Sprague-Dawley大鼠自然分娩。随机选择40 只雄性幼鼠为实验对象，于出生后第21天断奶，所有动物均在22t~25丈的受控环境中饲养，光照/黑暗周期为12 h。所有的幼崽都被允许随意获得 食物和水。乙二醛蒸汽干预方式：40%乙二醛溶 液用MB-10以8 mlVmin的流速蒸发，汽化气体通 过一个气体流体密封室进行循环，有两个输人和 输出出口，将大鼠置于密封室内2h/d、5cyw。根据 实验需要，将幼鼠随机分为4组，每组10只：①乙 二醛AD组（Gly-AD组）：在出生后48 h内皮下注 射辣椒素，剂量标准50 m g/kg，诱导AD模型，并通 过乙二醛蒸汽装置，接受乙二醛干预；②单纯AD 组（Air-AD组）：仅接受AD模型诱导，方法同前，但不接受乙二醛干预；③单纯乙二醛组（Gly-naive 组）：幼
鼠在出生后48 h内皮下注射赋形剂（含 10%吐温80和10%乙醇的生理盐水），剂量标准 50 m g/kg，仅接受乙二醛蒸汽干预；④对照组（Air-naive组）：仅在出生后1周幼鼠在出生后48 h内皮 下注射赋形。
1.2方法
1.2.1皮肤瘙痒及皮肤损害评估将大鼠分别放 入塑料小室，为了避免盲角，在房间的背面放了一 面镜子。在隔离的房间里用数码摄像机记录大鼠 的行为。在观看录制的视频时，记录者在不知道 老鼠属于哪一组的情况下计算了抓痕的数量。皮 肤损害评估：通过评分量化评估皮肤损伤，皮损范 围的单位大小为0.25 cm2，根据皮损的严重程度进 行评估（表1)。皮炎评分由严重程度指数乘以单 位大小计算。
表1皮肤损害评分标准
部位评分评价标准
0正常
面部/背部
1
2
鲁友社区3
毛发稀疏
脱发或红斑
出血或结痂
0正常
耳朵
1
2
3
民革党员什么意思片状损伤
出血或结棚
组织缺损
1.2.2大鼠血清和皮肤组织的采集及金葡菌的定 量检测行为测试6周后，处死大鼠，用1mL注射 器和26号针头采集右心房血液。从第2周到第6
周，每周获取2~4 mm皮肤，以定量测定金葡菌的 定植情况。采用免疫荧光染和RT-PCR法检测 AD大鼠颈后中部的皮损面积。在幼龄大鼠身上 切除并获得同一部位的非皮损皮肤。样品储存 在-801，在采集后4周内使用。皮肤样品（20〜50 mg)用分体式分散机HG-15，以6000 rpm制备皮肤 勾楽，10倍稀释。将稀释后的样品（100 mL)涂布 在HiCrom e Aureus琼脂基板上。培养板在37T；下孵育24 h，计数菌落数，以每毫克皮肤样本的集落 形成单位（CFU)表示。
1.2.3免疫荧光染及染强度评估皮肤标本 在4%甲醛溶液中固定24 h后，放入含30%蔗糖的 0.01M磷酸盐缓冲液中至完全浸泡。将样品包埋 在复合液中，用干冰快速冷冻。然后，将样品在低 温恒温器中切成5 mm厚的切片；用兔抗(3-defen-S in-2多克隆抗体（1:40稀释）和兔抗LL-37多克隆 抗体（1:500)进行免疫染，在含有0.2%Triton X-100、5%胎牛血清的PBS中稀释。将抗兔IgG与荧光素-异硫氰酸盐（FITC, 1:200)在与一抗相同的 缓冲液中37T；孵育l h。孵育前后的所有漂洗液 均含0.2%TritonX-100的PBS。并使用共聚焦显微 镜拍摄。米用ImageJ软件对角质细胞层绿成分 的每像
素点荧光强度进行定量估计。以真皮内未 染细胞胞浆面积的荧光强度作为背景。从角质 形成细胞层的荧光强度中减去背景强度，计算出 荧光密度分数。对于每个组织样本，使用同一载 玻片中两个视野的荧光密度分数的平均值作为 结果。
丨.2.4实时定量RT-PCR(Q丨T R)对于每个皮肤 样本，添加lmLTRIZOL试剂。然后，用分体式分 散机HG-15以6 000 rpm的速度匀浆3次，每次10 s，从匀浆的组织中提取RNA。使用M-MLV逆转 录酶从提取的RNA样本中获取cDNA，进行qPCR 扩增。每个目的基因的mRNA相对表达被归一化 为GAPDH的相对表达量。RT-PCR中使用的引物 如表2所示。
解剖学研究2021年第43畚第I期 Amu Kes.2021. V d.43. M».l
基因GAPDH 1L-4 IL.-5
1FN-7 TNF-a
表2基因引物序列
_________正义链（5’-3’)__________
5' -ACTGTGGCAAATTCGTGGGG-3'
5' -GCCCACCTTGGTCTCAGCCC-3'
5 ’ -GGCACTGTGGGAGGGAAATA-3 ’
5' -AGTGAACAACCCGTTCGAGA-31
5' -CTCCTCTCCGAAAGTCAGCG-3'
_________________反义链__________
5' -TGGGGGTACACATGGAAACG-3'
5' -CTCCTTGTTGCCCGTGGTGT-3'
5 ’ -ATCACGCCAACTCAGGAACT-3 ’
5 ’ -CAGCACCGCAGAATACTCCT -3 ’
5' -AAGTAGACCCTCCATGCCCG-3'
1.2.5酶联免疫吸附试验(EUSA)血清IgE水平 采用大鼠IgE ELISA试剂盒，血清IgG2b使用大鼠 IgG2b ELISA试剂盒，根据制造商的方案进行定量 检测。
1.3统计学分析
所有数据应用SPSS 20.0软件进行统计学分 析，计量资料以均值±标准差表示，多组间 比较采用多因素方差检验，两两比较采用LSD法 进行。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1乙二醛暴露加重AD大鼠瘙痒和皮炎
对大鼠进行密切的监视以评估乙二醛暴露对 瘙痒和皮肤炎的影响，结果发现，大鼠皮炎开始于 3周，暴露于乙二醛的AD大鼠面部皮肤炎显著加 重（图1A和B)，抓痕的数量也显著增加（图1C)。相反，在幼鼠中，皮炎或瘙痒症状没有显著变化(图1D和E)。这些结果表明，暴露于乙二醛会加 剧AD大鼠的A D样症状，但不会引起幼鼠的症状。
2.2暴露于乙二醛可增加大鼠的金葡菌皮肤定植
皮肤匀浆培养结果显示，暴露于乙二醛增加 了金葡菌在AD大鼠皮肤中的生长，并诱导了金葡 菌在幼鼠皮肤中的定植（图2A)。金葡菌CFU定 量结果显示，暴露于乙二醛后，AD大鼠的金葡菌 生长在4周龄时显著增加，并逐渐增加到6周龄，Gly-naive大鼠的金葡球菌定植始于3周龄，但程 度低于Air-AD大鼠。在AD大鼠中，金葡球的生 长在4周龄时显著增加，而Gly-naive大鼠的金葡 球定植始于3周龄，
但程度低于Air-AD大鼠（图2B和C)。这些结果表明，在没有预先存在皮肤屏 障功能障碍的情况下，单独暴露于乙二醛尽管能 促进幼鼠完整皮肤和AD大鼠受损皮肤中金葡菌 的生长，但并不能在幼鼠中诱发AD 。
解剖学研究2021年第43卷第1期A n a丨Res,2021, Vol.43, N o.145
O 夸Gly-AD(n=13)
-Q- Air-AD (n=12)
®
♦Gly-ADU=13)
Air-AD U=12)
图1乙二醛暴露加重A D大鼠瘙痒和皮炎A.各组第5周时面部皮肤炎；B.3~6周龄AD大鼠暴露乙二醛后皮炎评分的时间变化;
C.幼鼠暴露乙二醛后皮炎评分的时间变化；
D. 3~6周龄AD大鼠接触乙二醛后抓挠行为的时间变化；D.幼鼠接触乙二醛后抓挠行为的时间变化
2.3 乙二醛对大鼠表皮(3-defensin-2和LL-37表达的影响
抗菌肽可保护皮肤免受外来病原体的侵袭，因此，我们进一步对大鼠皮肤中LL-37和p-defen-sin-2的表达进行了比较分析。免疫荧光染显 示，AD大鼠皮肤表皮层中LL-37和P-defensin-2 的表达显著高于幼鼠。与金葡菌定植结果相似，暴露于乙二醛后，AD和幼鼠表皮中LL-37和P-defensin-2的表达也明显升高。这表明，抗菌 肽表达的变化与乙二醛对金葡菌定植的增加有 关（图3 )。2.4乙二醛暴露加重Th1相关炎症反应
细胞因子检测显示，乙二醛暴露后AD大鼠 TNF-ct和IFN-"ymRNA表达显著升高（图4A)，而幼 鼠TNF-a和IFN-7mRNA表达增加不明显（图4B)。同时，暴露于乙二醛对AD和幼鼠IL-4和IL-5mRNA的表达没有明显影响（图4B)。由于 IgG2b在大鼠中受T h l相关细胞因子的控制，我们 检测了血清中IgG2b的产量。然而，无论是AD大 鼠还是幼鼠，暴露于乙二醛后血清IgG2b水平均 保持不变。然后，我们进一步测量了血清中IgE 的产生，与Th2相关细胞因子mRNA
武汉十五中张飞跃
表达结果一
六甲基二硅氧烷
46解剖学研究2021 年第43 卷第1期Anat Res, 2021, Vol.43, No.l
图2暴露于乙二醛可增加大鼠的金葡菌皮肤定植A.第6周皮肤匀浆培养中的金葡菌菌落；B.匀浆皮肤培养液中金葡菌菌落数量随时间变化;C.乙二醛暴露对皮肤匀浆培养第6周金葡菌菌落数量的影响
Blue-DAPI / Green-LL-B7 Blue-DAPI /
图3乙二醛对大鼠表皮P-defensin-2和L L-37表达的影响 A.U-37在4组大鼠表皮层的表达；B.p-(丨efensin-2在4组大鼠表皮层 的表达
致，乙二醛对A D和幼鼠血清I g E水平无明显影响。这表明，暴露于乙二醛可上调A D大鼠皮肤中的T h l免疫反应，而对T h2免疫反应无明显影响。见图4。
3讨论
本研究证明暴露于乙二醛会加重A D大鼠的两个主要症状，即瘙痒和皮炎，但不影响幼鼠。同 时，这种症状恶化伴随着金葡菌皮肤定植的增加，随后抗菌肽也会反应性表达增加，包括P-d e f e n s i n -2等。此外，我们还证明了，暴露于乙二醛会增加皮损皮肤中T h l相关细胞因子的产生，如T N F-a和 I F N-7。流行病学研究表明，P M等室外空气污染物会促进健康人A D的发展，加重A D患者的
症
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