载香豆素-6聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒包封率的测定 孙蓉;许小艺;徐伟;杨宜华
【摘 要】利用高效液相谱(HPLC)法,建立香豆素-6(Cou-6)含量测定方法,采用高速离心法分离游离药物,从而测定Cou-6含量并计算载Cou-6聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒的包封率.实验所得结果显示Cou-6在1~50 μg·L-1范围内线性关系良好(r=0.9998),平均回收率为100.05% ±2.03%, PLGA纳米粒的包封率为89.65% ±5.23%.根据结果表明该方法简便迅速、准确可靠,为纳米粒的质量评价提供参考.%High-performance liquid chromatography (HPLC) was used to establish a method for determination of coumarin-6 (Cou-6) and the high-speed centrifugation was applied to separate from free drug. Then the entrapment efficiency of Cou-6 loaded PLGA nanoparticles could be calculated. The results showed that a good linear relationship was acquired when the concentration of Cou-6 was within the range of 1~50 μg·L-1(r=0.9998),the average recovery was 100.05% ±2.03%. Entrapment efficiency of coumarin-6 loaded PLGA nanoparticles was 89.65% ± 5.23%. The results demonstrated that the method was simple,fast,accurate and reliable.
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2018(046)003
【总页数】3页(P84-85,113)
【关键词】PLGA纳米粒;香豆素-6;包封率;高效液相谱
【作 者】五颜六的小老鼠孙蓉;许小艺;徐伟;杨宜华
【作者单位】徐州医科大学药学院,江苏 徐州 221004;徐州医科大学药学院,江苏 徐州 221004;徐州医科大学药学院,江苏 徐州 221004;徐州医科大学药学院,江苏 徐州 221004;江苏省新药研究与临床药学重点实验室,江苏 徐州 221004
【正文语种】中 文
【中图分类】R944.9
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聚合物纳米粒是以高分子材料为载体的纳米制剂，广泛应用于缓控释给药系统及靶向给药
系统[1-2]。聚乳酸羟基乙酸共聚物([poly(lactic-co-glycolic acid)]，PLGA)，是一种常用的生物可降解聚合物，生物相容性良好，无毒，已被FDA认证并批准收录为药用辅料[3-4]。香豆素-6(coumarin-6，Cou-6)是一种检测灵敏度高的脂溶性荧光染料，文献报道包载0.05%香豆素-6的纳米粒，显微镜下即可观察到较强烈的荧光[5]。近年来，其常被作为稳定的非pH依赖的荧光标记物包载于微粒给药系统内，进行给药系统的体内示踪、细胞摄取及转运机理研究[6]。本实验采用HPLC法测定载 Cou-6 PLGA纳米粒的含量，高速离心法分离游离药物，从而计算其包封率，为纳米粒的质量评价提供参考。
1.1 仪 器
LC-2010A型高效液相谱仪，日本岛津公司；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司；Nicomp 380ZLS粒度分析仪，美国Particle sizing systems公司；TGL20M高速冷冻离心机，湖南迈达仪器有限公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；KQ-250型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。 1.2 试 剂
聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA，50/50，η=0.21)，山东省医疗器械研究所；聚乙烯醇(PVA)，美国Sigma公司；香豆素-6(Cou-6)，美国Aladdin公司；甲醇(谱纯)，美国TEDIA公司；二氯甲烷(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。
义务教育课程标准实验教科书语文七年级上册2 方法与结果
2.1 载香豆素-6(Cou-6)PLGA纳米粒的制备
采用乳化溶剂挥发法制备PLGA纳米粒[7]。PLGA，Cou-6溶于二氯甲烷和甲醇(7:1)的混合溶剂中形成有机相，与2%PVA溶液(水相)混合，涡旋1 min，探头超声2 min(工作3 s，停3 s)，置于磁力搅拌器上搅拌，除去有机溶剂，即得到纳米混悬液。利用粒度分析仪测得粒径为(160.5±2.1) nm，多聚分散指数(polydisperse index，PDI)为0.13±0.06。
2.2 Cou-6含量测定分析方法的建立宵禁令
2.2.1 谱条件
谱柱：Agilent ZORBQX Bonus-RP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水
=95:5；检测器：RF-10AXL 荧光检测器；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：激发波长Ex=466 nm，发射波长Em=504 nm；进样量：20 μL。
2.2.2 特异性
取适量空白纳米粒和载Cou-6纳米粒混悬液，加入甲醇超声破乳，定容，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液。取上述样品与Cou-6甲醇溶液分别进样分析，记录谱图(图1)。结果表明，在选定的谱条件下，Cou-6的保留时间约4.7 min，峰形良好，溶剂和空白纳米粒不干扰Cou-6的含量测定。
图1 Cou-6的HPLC谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Cou-6
2.2.3 标准曲线及线性范围
精密称取Cou-6 10 mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.1 g·L-1的Cou-6贮备液；取贮备液，甲醇稀释成Cou-6浓度分别为1，2，5，8，10，20，50 μg·L-1的系列标准溶液，按“2.2.1”项下谱条件进样分析，记录谱图，以Cou-6浓度C(μg·L-1)对峰面积A进行线性回归，得标准曲线方程为：A=90257C-1204(r=0.9998)。Cou-6浓度在
1～50 μg·L-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。
2.2.4 定量下限
以标准曲线上的最低点浓度作为定量下限，则Cou-6定量下限(LLOQ)为1 μg·L-1(S/N>10)。用甲醇配制浓度为 1 μg·L-1的样品溶液6份，进样，该浓度点的准确度为100.0%～106.0%，RSD值小于3.0%。
2.2.5 稳定性
取载Cou-6纳米粒混悬液于室温下放置12 h，加入甲醇超声破乳，定容至10 mL，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液进样分析，结果表明载Cou-6纳米粒混悬液在12 h内稳定，RSD为1.72%。
2012豪门盛宴2.2.6 精密度
分别取浓度为2、8、20 μg·L-1的Cou-6对照品，连续进样分析5次，各浓度峰面积的RSD均小于1%，表明仪器精密度良好。
2.2.7 回收率
分别精密吸取“2.2.3”项下配置的浓度分别为2，8，20 μg·L-1的Cou-6标准溶液5 mL，加入Cou-6纳米粒中，混合均匀后加入甲醇超声破乳，定容至10 mL，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液，得到低，中，高3种浓度的样品溶液，进样分析后计算回收率。结果显示平均回收率为100.05%±2.03%，RSD为1.36%，表明回收率良好。
2.3 包封率的测定
纳米粒混悬液16000 rpm 4 ℃离心30 min，得到纳米粒沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS，0.1 M，pH=7.4)洗涤3次，PBS重悬置于4 ℃备用。取纳米粒适量，甲醇超声破乳，定容，取20 μL进样分析，将峰面积带入标准曲线方程，得到药物总量及包封的药物含量。依据包封率(%)=(纳米粒中包封的药物/纳米粒中药物总量)×100%，计算包封率为89.65%±5.23%。
3 结 论
包封率是纳米粒的一个重要质量评价指标。Cou-6作为模型药物，其在纳米粒中的包封率测定具有重大意义。游离药物和纳米粒的分离是包封率测定的关键。目前，常利用透析法
键盘映射、高速离心法、低速离心法、超滤法、葡聚糖凝胶柱过滤法等方法分离游离药物和纳米粒[8-11]。本实验曾采用透析法、葡聚糖凝胶过滤法，耗时长，所耗介质多，且易造成药物渗漏，测定包封率误差较大。本文纳米粒的平均粒径约160 nm，采用高速离心法可除去游离药物，且操作简便。利用HPLC法可快速测定Cou-6的含量。本实验建立的纳米粒Cou-6包封率测定的方法，简便可靠，灵敏度高，重现性好，为纳米粒的质量评价提供参考。
参考文献
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[2] Masood F. Polymeric nanoparticles for targeted drug delivery system for cancer therapy[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2016,60:569-578.
[3] Kumari A, Yadav S K, Yadav S C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2010,75(1):1-18.
[4] Di Toro R,Betti V, Spampinato S. Biocompatibility and integrin-mediated adhesion of human osteoblasts to poly(DL-lactide-co-glycolide) copolymers[J]. Eur. J. Pharm. Sci.,2004,21(2-3):161-169.
[5] Panyam J, Labhasetwar V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue[J]. Adv. Drug Deliv. Rev.,2003,55(3):329-347.
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