1、分光光度法
1、测定原理：
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2、测定步骤：
① 试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，
慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。 ② 试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄，再滴加乙酸溶液至溶液无，用水稀释至刻度，混匀。
③ 标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比管中。加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm 比杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。
④ 试样测定：吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL 比管中。以下按上述中“加4 mL 乙酸钠-乙酸缓酸溶液（pH 4.8）及4 mL 显剂……”起操作。试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含
量。
3、特点：
① 本法省去了蒸馏、滴定，简化了操作，无需特殊的仪器与试剂，便于广范应用，为蛋白质的测定提供了凯氏定氮法的简化方法。 ② 本法所用消化设备简便，常用，消化时间短，易于推广。
③本法采用硫酸铵作为铵离子标准溶液，避免引入其它杂质。
二、凯氏定氮法
1、测定原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
2、测定步骤：
① 试样处理：称取充分混匀的固体试样 0.2 g～2 g、半固体试样 2 g～5 g 或液体试样10 g～25 g（约相当于30 mg～40 mg 氮），精确至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸铜、6 g 内科学硫酸钾及20 mL 硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿并澄清透明后，再继续加热0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入20 mL 水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
② 测定：装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3 处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
③ 向接收瓶内加入 10.0 mL 硼酸溶液及1 滴～2 滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0 mL～10.0 mL 试样处理液由小玻杯注入反应室，以10 mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0 mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏
气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2 份甲基红乙醇溶液与1 份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜由紫红变成灰，pH 5.4；1 份甲基红乙醇溶液与5 份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜由酒红变成绿，pH 5.1。同时作试剂空白。
3、特点：凯氏定氮法测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大；李宁认为凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法,适用样品广泛,测试结果准确，被国际国内作为法定的标准检验方法。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。
4、注意事项：
① 样品在消化时加入浓硫酸的量必须过量,管妖妖的风花雪月一是脱水作用,将样品中有机物脱水然后碳化成C；二是氧化作用,浓硫酸和硫酸钾、硫酸铜一同加热使温度达400e以上,碳还原硫酸生成SO2,碳本身被氧化成CO2；三是分解作用,将蛋白质分解,SO2还原N生成NH+4,本身被氧化
成SO师东兵3；四是吸收作用,生成的NH+4与浓硫酸反应生成(NH4)2SO4；五是生成的(NH4)2SO4保存在浓硫酸溶液中不至于损失。
② 样品消化过程要加入催化剂,加入硫酸钾能够提高分解时溶液的温度,使溶液沸点由290e提高到400e,加入硫酸铜、和硒粉则能促进试样的分解,缩短消化时间。
③ 样品消化过程中,消化液经过一系列改变最终转变为绿透明状态,这种过程是碳化的有机物完全被氧化变化,但不表示样品中的氮素全部转变为NH+4。
三、燃烧法
1、测定原理：试样在900 ℃～1200 ℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测仪（TCD）进行检测。
2、测定步骤：
称取0.1 g～1.0 g 充分混匀的试样（精确至0.0001 g），用锡箔包裹后置于样品盘上。试
样进入燃烧反应炉（900 ℃～1200 ℃）后，在高纯氧（≥99.99%中国物业管理）中充分燃烧。燃烧炉中的产物（NOx）被载气CO2 运送至还原炉（800 ℃）中，经还原生成氮气后检测其含量。
四、滴定法
（一）甲醛（指示剂）滴定法
1、测定原理：酸消化液中的铵盐与中性甲醛作用,生成六次甲基四铵,同时释放出定量的酸,用碱标准溶液直接滴定。
2、特点：该法节省试剂，分析速度快,操作简便易行。刘玉兰等分别用甲醛滴定法和凯氏定氮法测定棉籽饼、大豆、花生、小麦、玉米和蚕豆等蛋白质含量,结果基本一致，偏差<0.20。
（二）PH滴定法
1、测定原理：pH滴定法是指酸碱滴定至某一制定pH值时,根据滴定剂用量和有关公式计算被测物浓度或含量的方法。它是在水溶液中直接滴定极弱酸碱的最新方法。pH滴定法是将
样品中蛋白质消化成(NH4)2SO4，然后用NaOH滴定至指定pH值，再根据有关公式计算样品中蛋白质含量。
2、特点：当滴定浓度不变时,被测组分弱酸(碱)的量直接与滴定剂加入量(体积)成正比,因而不必事先标定滴定剂浓度。该方法必须确定合适的pH值。
五、Folin-酚试剂法(Lowry法)
1、测定原理：
Folin-酚法是双缩脲法的发展,结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,其中包括两步反应,第一步是在碱性条件下蛋白质中的肽键与铜试剂起显反应,生成蛋白质)铜络合物;第二步是蛋白质)铜络合物上的酪氨酸和氨酸等芳香族氨基酸残基将磷钼酸)磷钨酸试剂美国种族简史(酚试剂)还原,生成深蓝的化合物,其颜深浅与蛋白质含量呈正相关。
2、特点：
① Folin-酚法广泛应用于水溶性蛋白质含量的测定。Folin-酚法的灵敏度比双缩脲法高100
倍,肽键显效果增强减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法由于两步呈反应可以叠加,其灵敏度特别高,所以适于20~250Lg微量蛋白质的测定,可检测的最低蛋白质量达5ug。
② 在测定时应注意,酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此试验的反应只在pH=10时才发生,所以加酚试剂时必须立即混匀,以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显程度减弱。
③ Folin-酚法试剂配制繁琐耗时。酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和脲素均会干扰反应,但质量分数或体积分数在5%时,尿素、硫酸钠、硝酸钠、三、乙醇、乙醚和丙酮对显无影响,高浓度时必须作校正曲线。
六、BCA法
1、测定原理
在碱性溶液中,蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与测定试剂中的BCA(bicinchoninic acid,二喹啉甲酸)作用形成紫红复合物,在562 nm处具有最大吸收峰。在一定条件下,此复合物的
光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
2、特点
BCA蛋白质检测试剂是当前比Lowry法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品,该法快速灵敏、稳定可靠且对不同种类蛋白质变异系数甚小,可检测到0.5ug,是目前已知的最灵敏的蛋白质检测试剂之一。该法操作简单,试剂十分稳定, 因此对时间控制不需那么严格。显后, 1h内读A56值无变化。抗试剂干扰的能力强。
七、双缩脲法
1、测定原理
具有两个酰胺基或两个相连的肽键的化合物皆有双缩脲反应!在碱性溶液中双缩脲与 Cu2+形成紫配合物，在 540nm 处有最大吸收，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜成正比。实战能力
2、特点
双缩脲法对不同的蛋白质产生颜的深浅相近,不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一,方法简便，但灵敏度差，测定范围为1～20 mg 蛋白质。适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。双缩脲法在需快速但不需要精确的测定中比较实用，因为 Cu2+很容易受到干扰而被还原。
参考文献：
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