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蛋白质、氨基酸、糖的鉴别试验及其比较

蛋白质

1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。

2.双缩脲反应biuret reaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫络合物的呈反应。在540nm 波长处有最大吸收。可用于蛋白质的定性和定量检测。

　紫络合物分子结构式

在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。

假声唱法双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜反应。一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫或蓝紫

络合物。

注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。

双缩脲反应的鉴定

由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。边界元法

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈反应，铜离子也容易被还原，有时出现红沉淀。

配制双缩脲试剂的注意事项双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！

蛋白质检测方法比较

方法	灵敏度	时间	原理	干扰物质	说明
凯氏定氮法	傅里叶变换对灵敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，误差为±2%	费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4个小时	将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定	非蛋白氮（可用三沉淀蛋白质而分离）	用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间剖腹自杀
双缩脲法	灵敏度低，1-20mg	中速20-30分钟	多肽键+碱性Cu2+紫络合物	硫酸铵：Tris缓冲液，某些氨基酸	用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显相似
紫外吸收光法	较为灵敏，50-100微克	快速5-10分钟	蛋白质中的络氨酸和氨酸残基在280nm处有紫外光吸收	各种嘌呤和各种核苷酸	用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正
考马斯亮蓝法	灵敏度最高，1-5微克人种学	快速5-15分钟	考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝其λmax由465nm变为595nm	强碱性缓冲液，TritonX-100SDS	最好的方法，干扰物质少，颜稳定，灵敏度高颜深浅随不同蛋白质变化
Folin酚试剂法	灵敏度高，<5微克	慢速40-60分钟	双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原	硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇	耗费时间长；操作要严格计时；颜深浅随不同蛋白质变化

氨基酸

茚三酮鉴别试验的反应方程式：

氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。脯氨酸为黄化

合物，谷丙酰胺和天冬酰胺为棕化合物。

糖分的鉴别实验

1. Fehling试验生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红氧化亚铜沉淀。若有非还原性低聚糖及多糖存在，则必须加稀酸水解后，才能与Fehling试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖，其中单糖和某些二塘具有有力羰基，是还原糖，多糖和蔗糖没有还原性。

斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。

CuSO4 + 2NaOH=====Cu（OH）2 + Na2SO4

2CH3(CH2OH)4CHO + 2 Cu(OH)2 ---（加热）--→ 2 CH3(CH2OH)4COOH+ Cu2O(砖红沉淀) + 2 H2O

2. Molish试验生药水浸液，加a -萘酚试剂数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，若有糖类成分与甙类存在，则在二液面交界处出现紫红环。

紫红复合物

3. 成脎试验生药的水浸液与盐酸苯肼液共热，只要有糖类成分存在，即生成黄的糖脎结晶。镜检结晶，可视结晶的形状而鉴定出糖的种类。

4. 层析法取生药浸出液（多糖类需水解），以某种糖为对照品一起进行层析检测。常用纸层析法，正丁醇-乙酸-水（4 : 1 : 5上层）作展开剂，新配制的氨化硝酸银溶液为显剂，结果还原糖形成黑斑点。

糖检测方法比较

方法	原理	试剂	操作	说明
Molish反应——α-萘酚反应	糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在	Molish试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕瓶保存。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。	取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1 mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。	单糖、双糖、多糖一般都发生此反应，但氨基糖不发生此反应。丙酮、甲酸、乳酸、草酸、葡萄糖醛酸、各种醛糖衍生物、甘油醛等均产生近似的颜反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。
蒽酮反应	糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿复合物。该复合物在630nm有最大的吸收峰，并且在一定范围内，颜与糖量的多少成正比	蒽酮试剂：取0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸中，当日配制。待测糖溶液，同Molish试验。	取试管，编号，均加入1ml蒽酮溶液，再向各管滴加2 ~ 3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜变化并记录。	该方法可以用于测定几乎所有碳水化合物的含量，包括戊糖、己糖，多糖等。
酮糖的Seliwanoff反应	酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。	Sediwanoff试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。 1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。	取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜的变化过程。	酮基本身没有还原性，只有在变成烯醇式后，才显示还原作用。
Fehling试验	费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄或砖红的氧化亚铜沉淀。由于沉淀的速度不同，而形成的颗粒大小也不同，颗粒大的为红，颗粒小的为黄。	试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。试剂乙：称取125g NaOH 137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。	取试管，编号，各加入Fehlin试剂甲和乙1mL。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2 ~ 3min，取出冷却，观察沉淀和颜变化。	为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。
Benedict试验（本尼迪特试验）	Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。		取试管，编号，分别加入2mL Benedict试剂和4滴待测糖溶液，沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜变化。
Barfoed试验（巴弗德氏试剂）	在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红的氧化亚铜，时间约为3分钟，而还原二糖则需20分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。 LG KG90N		取试管，编号，分别加入2mL Barfoed试剂和2 ~ 3滴待测糖溶液，煮沸2-3分钟，放置20分钟以上，比较各管的颜变化。	还原二糖：麦芽糖、乳糖、纤维二糖

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