第39卷第1期注為科修Vol.39No.1 2021年2月JIANGXI SCIENCE Feb.2021
doi：10.13990/j.&(1001-3679.2021.01.009
王金昌，靳亮，占智高，况文东，关丽梅，陈俊辉
(江西省科学院微生物研究所,330096，南昌)
摘要：以甜菜夜蛾幼虫作为替代宿主增殖草原毛虫核型多角体病毒(GrNPV)的研究结果表明，GrNPV在甜菜夜蛾体内连续传代2次后得到了GrNPV-Se2,GrNPV-Se2切片电镜图具有典型的杆状病毒特征。分别提取GrNPV-Se2与GrNPV基因组，电泳结果表明GrNPV-Se2与GrNPV基因组大小相同。设计GrNPV多角体基因引物，对GrNPV-Se2与GrNPV基因组进行PCR验证，结果GrNPV与GrNPV-Se2基因组的多角体基因PCR产物带型相同，表明用甜菜夜蛾幼虫成功增殖了草原毛虫核型多角体病毒GrNPV。 关键词：草原毛虫；核型多角体病毒；甜菜夜蛾；替代宿主
中图分类号:S476.13文献标识码:A文章编号：1001-3679(2021)01-041-04
Propagation of Gynaephora ruoregensis Nuclear Polyhedrosis Vims
ii Substitutive Host Spodoptera exigua Larvae
报童模型
WANG Jinchang,JIN Liang,ZHAN Zhigao,KUANG Wendong,GUAN Limei,CHEN Junhui (Institute of Microbiology,Jiangxi Academy of Science,330096,Nanchang,PRC)
Abstract:Using Spodopera exigua larvae as a substitutive host for the proliferation of Gynaephora ruoregensis NucOar Polyhedrosis Virus(GrNPV)was studid,GrNPV-Se2was obtained afteN GrNPV was propaaated twicc in Spodoptera exigua larvae.The eictron microscope of GrNPV一Se2 showed typiccl baculovirus characteristics.the gnomes of GrNPV一Se2and GrNPV wero extracted respectively.The eictrophoresis oesuys showed that the genome size of GrNPV一Se2and GrNPV was the same.The primero of GrNPV polyhedriv gene wcro designed,and the genomes of GrNPV一Se2and GrNPV wero arified by PCR,the PCR products of GrNPV-Se2and GrNPV we r e the same,which indicated that GrNPV was successfully propagated from Spodoptero exigua larvae.
'ey words:Gnaeppora ruoergensis Choo eg ygg；Nucleopolyhodrovirus;SpodopttN exigua;substitutive host
0引言
草原毛虫(Gnaeppora reoergensis Chou et ying)为我国高原牧区的重要害虫，别名红头黑毛虫、草原毒蛾，属于鳞翅目、毒蛾科，全球共有15种草原毛虫，主要分布在极地和高寒地带。草原毛虫主要为害莎草科、禾本科、豆科、蓼科、蔷薇科等各类牧草，草原毛虫爆发危害严重，将牧草的大部分茎叶吃光，只剩下枯枝残叶，影响牧草生长，造成草原缺草，严重影响畜牧业的发展⑷。草原毛虫不仅危害牧草，而且对人畜也有一定的影响，其体毛和茧毛有毒，牛羊采食了带虫或茧的牧草,
收稿日期:2020-10-10；修订日期:2020-11-30
作者简介：王金昌(1975—)，男，副研究员，研究方向：生物技术。
基金项目：江西省重点研发项目一般项目(20192BBF60056,20202BBFL63050)
-42-江西科学2021年第39卷
会引起口腔粘膜红肿，起泡，齿根或舌头糜烂等⑵o 草原毛虫核型多角体病毒(Gynaephora ruore-gensis Nuclear Polyhedrosis Virus,GrNPV)对草原毛虫有较强的毒力，GrNPV对人和脊稚动物无感染性、致病性和其他毒性⑶，而且能够通过水平扩散和垂直传递在害虫种内形成病毒。刘世贵等于1982—1983年在川西北草原首次分离到GrNPV，初步生测实验表明GrNPV对草原毛虫具有较强的感染致死能力⑷。刁治民于1987年从青海省海北州草地上罹病死亡青海草原毛虫幼虫分离获得GrNPV，
试验结果显示GrNPV对草原毛虫有较强的毒力，其杀虫效果达85%，并有后效作用⑸。王金昌等到叙海-则岔国家自然保护区利用草原毛虫成功增殖GrNPV⑷°
但是利用草原毛虫增殖GrNPV面临着一个难题，就是草原毛虫虫源的问题。野生的草原毛虫只有在5月、6月和7月这3个月才适合增殖GrNPV。目前，草原毛虫的人工饲养没有解决，所以利用草原毛虫难以大量增殖GrNPV，难以实现GrNPV的商品化。
本实验利用甜菜夜蛾幼虫成功增殖GrNPV，解决了大量增殖GrNPV的难题。
1试验部分
1.1材料
1.1.1甜菜夜蛾虫卵和甜菜夜蛾的人工饲料
购置于济源科云生物有限公司。
1.1.2GrNPV中科院武汉病毒所馈赠。
1.2实验方法
1.2.1Gr N PV感染草原毛虫参照以前的方法⑷，将甜菜夜蛾虫卵放置于恒温培养箱,27七孵化，用人工饲料饲养甜菜夜蛾幼虫到3龄。用Gr N PV感染草原毛虫，从草原毛虫病死虫尸提取、纯化病毒，取少量病毒寄送中科院武汉病毒所进行切片鉴定。
1.2.2Gr N PV对甜菜夜蛾幼虫传代感染参照步骤1.2.1，用无菌水将Gr N PV配成1x10*PIB/mL、1X10PIB/mL、1X10PIB/mL、1X10PIB/mL、1x10"PIB/mL、1x10PIB/mL的6个浓度，分别取10$L病毒添加到少量饲料中喂饲甜菜夜蛾幼虫，对照组喂饲添加10$L dd&O的少量饲料，第2天添加没有病毒的饲料，饲养甜菜夜蛾幼虫至死亡或化蛹，第1代感染完成后，从病死甜菜夜蛾幼虫虫尸提取、纯化病毒，命名为Gr N PV-Se1；再用无菌水把Gr N PV-Se1配成1x10*PIB/mL,1 x10?PIB/mL、1x10"PIB/mL、1x10‘PIB/mL,1 x10"PIB/mL,1x10PIB/mL的6个浓度，进行第2代感染，第2代感染完成后，从病死甜菜夜蛾幼虫虫尸提取、纯化病毒第2代病毒，命名为Gr N PV-Se2，取少量病毒寄送中科院武汉病毒所进行切片鉴定。
1.2.3分别提取GrNPV和GrNPV-Se2基因组利用碱解液分别裂解GrNPV和GrNPV-Se2基因组多角体后，用酚、氯仿抽提病毒基因组切，-20七冰箱保存，用1%的琼脂糖电泳检测病毒基因组大小。
1.2.4PCR鉴定Gr N PV和Gr N PV-Se2基因组
利用2代测序技术对Gr N PV基因组进行全基因组测序，根据测序结果，设计Gr N PV多角体基因引物
polyhedrin-F:CGTGCACTCGAATAGCAT-GT、polyhedrin-R：GAATACAGGGGCGCATTGG，进行PCR验证。50$L PCR反应体系：1$L Gr N PV 基因组、1$L引物polyhedrin-F、1$L引物polyhedrin-R^1$LTaq酶(5U/$L)、4$L dNTPQ各2.5mM)、5$L PCR Buffer、37$Ldd&0。PCR 反应条件：94°C3min,94°C30s、55°C45s、72°C 1min、34个循环、72°C10min,12°C1h。
2试验结果与分析
2.1Gr N PV对甜菜夜蛾幼虫传代感染
在第1代感染实验中，甜菜夜蛾幼虫死亡率分别为47.9%、45.9%.54.2%,68.7%.75%、23%。但第2代感染，甜菜夜蛾幼虫死亡率都达到了99%，表明GrNPV-Se2对甜菜夜蛾幼虫具有很强的毒力。
2.2Gr N PV-Se2病毒切片鉴定
草原毛虫增殖的Gr N PV病毒切片电镜结果见图1，甜菜夜蛾幼虫增殖的GrNPV-Se2病毒切片见图2。从图1和图2可见，GrNPV和GrNPV -Se2切片电镜图都具有典型的杆状病毒特征。
2.3Gr N PV和Gr N PV-Se2基因组大小的鉴定
草原毛虫增殖的Gr N PV和甜菜夜蛾幼虫增殖的GrNPV-Se2的基因组电泳结果见图3。从图3可见GrNPV和GrNPV-Se2基因组大小相等。2.4PCR鉴定GrNPV和GrNPV-Se2基因组是
否为同一基因组
利用GrNPV多角体基因引物polyhedrin-F 和polyhedrin-R分别对GrNPV和GrNPV-Se2
第1期王金昌等：甜菜夜蛾幼虫增殖Gr N PV的研究-43-
图1草原毛虫增殖的Gr N PV切片电镜图
图2甜菜夜蛾幼虫增殖的GrNPV-Se2切片电镜图
（泳道1为10Kb Maker，泳道2为Gr N PV的基因组，
泳道3为Gr N PV-Se2的基因组）
图3草原毛虫增殖的Gr N PV和甜菜夜蛾幼虫增殖的Gr N PV-Se2基因组电泳图
基因组进行PCR扩增。PCR产物进行1%的琼脂糖电泳，电离泳结果见图4。
从图4可见，Gr N PV和Gr N PV-Se2基因组的多角体基因PCR产物大小相同，表明用甜菜夜蛾幼虫成功增殖了Gr N PV。
杆状病毒具有高度的宿特异性，一种病毒往往只能感染亲缘性较近的少数几种昆虫，并引起大面积流行。昆虫病毒有着严格的宿主特异性，
（泳道1为5000Kb Maker,
泳道2、4为Gr N PV的多角体基因PCR产物，
泳道3、5为Gr N PV-Se2多角体基因PCR产物）
图4PCR扩增GrNPV和GrNPV-Se2多角体基因的PCR产物电泳图
但近年积累起来的交叉感染实验资料，说明昆虫病毒的宿主特异性是相对的，同一科的不同属之间交叉感染的现象已很普遍，少数发生在科甚至目之间的交叉感染岡。
家蚕核型多角体病毒能感染甘蓝夜蛾幼虫、甜菜夜蛾幼虫、苹掌舟蛾幼虫、黄杨斑蛾幼虫、舞毒蛾幼虫，感染发病率分别为43.2%、56.3%、7.8%、16.4%呵。芹菜夜蛾核型多角体病毒能感染棉铃虫幼虫和小菜蛾幼虫3］。甘蓝夜蛾核型多角体病毒可感染玉米草地贪夜蛾幼虫⑴］、蜀柏毒蛾幼虫氏］、甘蓝夜蛾幼虫、小菜蛾幼虫。张忠信报道甘蓝夜蛾核型多角体病毒可感染32种以上鳞翅目害虫Z。
一种昆虫也可被多种病毒感染，甜菜夜蛾幼虫被报道增殖了多种病毒：如肖宇宙等利用甜菜夜蛾幼虫作为替代宿主成功增殖马尾松毛虫质型多角体病毒］，赵正萍等利甜用菜夜蛾幼虫增殖了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒少］。
3结论
本实验利用甜菜夜蛾幼虫成功增殖了GrN-PV，解决了大量增殖GrNPV的难题。因为甜菜夜蛾幼虫适合进行集饲养，可以节省人资源、降低生产成本，而且室内饲养没有季节和虫源的限制，有利于规模化繁育。用甜菜夜蛾幼虫大量增殖Gr N PV，可以实现Gr N PV的商品化。
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