Vol.7 No.1Feb. 2021
生物化工
Biological Chemical Engineering
第 7 卷 第 1 期2021 年 2 月
张博慧，贾戴辉，许俊彦*
（宝船生物医药科技（上海）有限公司药物分析部门，上海 201203）
摘 要：目的：采用高效液相谱-荧光检测器法（HPLC-FLD）测定单克隆抗体注射液中吐温80的含量，并进行方法学验证。方法：按设定的谱条件对检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的HPLC-FLD 法进行方法学验证，包括专属性、精密度、准确度、线性和范围、耐用性，并采用该方法对不同单克隆抗体注射液进行检测。结果：经验证，该方法具有专属性；重复性验证试验中，保留时间和含量的RSD 值分别为0.5%和0.4%；中间精密度验证试验中，保留时间和含量的RSD 值分别为0.4%和2.2%；准确度验证试验中，回收率分别为105%、98%和108%；线性相关系数为0.999 1，检测范围为0.05~0.80 mg/mL；不同批次反应线圈对检测结果无影响，不同品种单克隆抗体注射液吐温80含量检测结果偏差较小。结论：该方法具有专属性，线性关系良好，精密度和准确度较好，测定结果稳定可靠，适用于单克隆抗体注射液中吐温80含量的检测。
关键词：高效液相谱-荧光检测器；吐温80；单克隆抗体注射液中图分类号：R927.2 文献标识码：A
Determination of Tween80 Content in Monoclonal Antibody Injection by HPLC-FLD
ZHANG Bohui, JIA Daihui, XU Junyan *
(Drug Analysis Department, Dragonboat Biopharmaceutical, Co., Ltd, Shanghai 201203)
Abstract: Objective: To establish a method for the determination of Tween 80 in monoclonal antibody injection by
High-performance liquid chromatography fluorescence detector. Methods: Under designed condition, the method was verified for specificity, precision, accuracy, linearity, range and durability. The metho
d was also used to determination of Tween 80 content of different monoclonal antibody injections. Results: The HPLC-FLD method showed good specificity. In reproducibility test, the RSD of retention time and content were 0.5% and 0.4% respectively. In intermediate-precision test, the RSD of retention time and content were 0.4% and 2.2% respectively. The recovery rates were 105%, 98% and 108% respectively. The correlation Coefficient was 0.999 1 and the range was from 0.05 to 0.8 mg/mL. The different batches of reaction coils had no effect on the detection results. The Tween 80 contents in different mAb injections showed little deviation. Conclusion: The HPLC-FLD method showed good specificity, precision, accuracy and linearity, and the test result was stable and reliable, which was suitable for determination of Tween 80 content of different monoclonal antibody injections.
Keywords: High-performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector; Tween 80; monoclonal antibody injection
吐温80又名聚山梨酯80，其化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，作为助溶剂、乳化剂和稳定剂，常用于性单克隆抗体注射液制剂中[1]。近
年来，关于吐温80能够诱发过敏反应的报道越来越 多[2-6]，建立一种准确有效的测定吐温80含量的方法尤为重要。
作者简介：张博慧（1987—），女，河北沧州人，硕士，研究方向：工作药物分析。
通信作者：许俊彦（1984—），男，浙江金华人，博士，研究方向：工作药物分析。 E-mail：junyan.xu ＠dragonboatbio。
文章编号：2096-0387（2021）01-0031-06
·32·生物化工2021年
目前，用于检测吐温80含量的方法主要有比法[7]、高效液相谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）检测法[8]、水解法[9]、质谱法[10-11]等。比法因对设备要求比较低而应用广泛，但该方法耗时、重复性较差，且对蛋白浓度较高样品适用性差；HPLC-ELSD法检测结果较准确，应用范围较广，但是ELSD系统易受蛋白污染而影响检测结果；水解法是将吐温80水解成油酸，利用高效液相谱-紫外检测器检测，该方法耗时较长，易受油酸稳定性的影响；质谱法需要使用昂贵的仪器，因此使用范围受限。本研究建立了采用高效液相谱仪配备荧光检测器检测单克隆抗体中吐温80含量的方法，并进行了方法学验证。 1材料与方法
1.1试验材料
供试品单抗1、单抗2、单抗3均为宝船生物医药科技（上海）有限公司生产的单克隆抗体注射液；Humira（修美乐）购自雅培公司；Opdivo（欧狄沃）购自百时美施贵宝公司；Erbitux（爱必妥）购自默克公司。
1.2试剂与仪器
吐温80（药用级）购自威尔药业；十水四硼酸钠（ACS试剂级）、N-苯基-1-萘胺（NPN， 98%）均购自Sigma公司；氯化钠（HPLC级）购自阿拉丁公司；乙腈（ACN， HPLC级）购自Fisher公司；反应线圈（Reaction coil 750 μL）购自赛默飞公司；1260高效液相谱仪，安捷伦，配备荧光检测器。
1.3实验方法
1.3.1谱条件
柱温箱温度25 ℃，样品盘温度5 ℃，荧光检测器λex=350 nm、λem=420 nm；流动相为0.15 mol/L 氯化钠、0.025 mol/L十水四硼酸钠、5.0% ACN、5.0 mol/L NPN、2.5 mg/L吐温80；流速1.5 mL/min；进样量10 μL；等度洗脱。
1.3.2除蛋白试验
（1）分别将1倍、3倍、5倍和7倍体积的乙醇-氯化钠饱和溶液以及5倍体积的乙醇、乙腈加入样品中，震荡后离心，取上清测蛋白浓度。将上清干燥后用超纯水复溶，上机检测吐温80含量。
（2）由3名实验人员分别用5倍体积的乙醇-氯化钠饱和溶液沉淀蛋白，进行吐温80含量的测定。
1.3.3蛋白干扰试验
将不含吐温80的样品用超纯水稀释至蛋白浓度分别为20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL 和60 mg/mL，应用“1.3.1”谱条件直接进样分析。
1.3.4方法验证
1.3.4.1专属性
分别取阴性对照样品（不含吐温80，蛋白浓度 20 mg/mL）、不含吐温80的稀释缓冲液、浓度为 0.1 mg/mL的吐温80标准液和单抗1进行吐温80含量检测，验证各样品谱图在吐温80保留时间内的出峰情况。
1.3.4.2精密度
平行取6份单抗1进行吐温80含量检测，计算6个结果的保留时间和吐温80含量的RSD值进行重复性验证；由另一名实验人员重复该操作，计算两名实验人员12个结果的保留时间和吐温80含量的RSD值，并进行中间精密度验证。
1.3.4.3准确度
配制吐温80含量分别为0.05 mg/mL、0.10 mg/mL 和0.80 mg/mL，蛋白含量均为20 mg/mL的样品进行HPLC检测，统计各浓度样品的吐温80回收率。
1.3.4.4线性和范围
将吐温80标准品分别稀释至浓度为0.800 mg/mL、0.400 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL 和0.025 mg/mL，进行吐温80含量检测。以吐温80含量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制回归方程，并计算R2。符合精密度、准确度和线性的吐温80含量范围即为该方法的检测范围。
1.3.4.5耐用性
将样品置于样品储存室（5±3）℃内，分别于0 h、8 h、24 h和48 h进行吐温80含量检测，计算各时间点相对于0 h的吐温80含量的相对差值。应用不同批号的反应线圈分别进行吐温80含量的检测，计算
第1期·33·张博慧等：高效液相谱-荧光检测器法检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量
两个结果的相对差值。
1.3.5单克隆抗体注射液中吐温80含量的测定
应用“1.3.1”谱条件对6种单克隆抗体注射液进行吐温80含量的检测。
2结果与讨论
2.1除蛋白研究
为了消除蛋白对检测结果的影响，对供试品（单抗1，蛋白浓度20 mg/mL，吐温80含量0.1 mg/mL）进行除蛋白研究。用不同有机试剂（乙醇、乙腈、乙醇-氯化钠饱和溶液）及不同比例的乙醇-氯化钠饱和溶液沉淀蛋白，结果见表1。结果表明，虽然用乙醇沉淀蛋白后吐温80检测结果最高，但是由于其除蛋白效果较差，吐温80含量结果偏高有可能是受到蛋白的干扰所致。用乙腈及不同比例的乙醇-氯化钠饱和溶液除蛋白效果良好，5倍体积的乙醇-氯化钠饱和溶液吐温80回收率相对较好。
由3名实验人员分别平行制备6个样品，考察除蛋白操作的重复性。，试验结果见表2。表2结果表明，吐温80的回收率低，重复性差。2.2蛋白质干扰试验
由于除蛋白操作重复性差，吐温80含量回收率低，因此考虑用直接进样的方法进行上机检测，这需要
研究蛋白质对检测的干扰。选择与单抗1吐温80含量一致的0.1 mg/mL吐温80标准品作为参比，计算不同蛋白浓度样品峰面积与0.1 mg/mL吐温80标准品峰面积的比值，结果见表3和图1。结果表明，在蛋白含量为20~60 mg/mL，蛋白的干扰均较小。值得注意的是，蛋白含量越高，对检测的干扰越大，因此对于高浓度的蛋白样品，若选择该方法进行吐温80含量的检测，需要首先评估蛋白对检测结果的干扰程度，决定该方法是否适用。
2.3方法学验证
2.3.1专属性
图2显示，供试品和0.1 mg/mL吐温80标准品保留时间和峰面积一致；阴性对照样品峰和稀释缓冲液几乎无干扰（由于流动相中添加了一定比例的吐温80，所以稀释缓冲液在吐温80保留时间内出现倒峰，属正常现象）。
表1不同种类和比例有机试剂除蛋白试验结果
试剂种类试剂、样品体积比残留蛋白浓度/（mg/mL）吐温80含量/（mg/mL）回收率/%乙醇5∶1 2.90.088 088.0
乙腈5∶10.10.052 052.0
乙醇-氯化钠饱和
溶液1∶10.50.063 063.0 3∶10.30.062 762.7 5∶10.20.072 372.3 7∶10.10.068 368.3
表2不同实验人员吐温80检测结果
实验人员序号
平行样品/（mg/mL）
123456
10.0770.0670.0820.0750.0740.072
20.0930.0800.0680.0880.0700.088
30.0740.0700.0730.0780.0800.082
表3蛋白干扰试验
样品序号蛋白含量/（mg/mL）吐温80含量/（mg/mL）峰面积比值/% 1600208 374 1.6
2500156 905 1.2
3400108 4410.8
430068 8060.5
520026 2430.2 0.1 mg/mL吐温80标准品00.112 809 929
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生物化工
2021年
2.3.2 精密度2.3.2.1 重复性
重复性试验结果见表4，由结果可知，6个结果中保留时间和吐温80含量的RSD 值分别为0.5%和0.4%。
表4 重复性试验结果
重复保留时间/
min RSD /%
吐温80含量/ （mg/mL）
RSD /%10.4780.5
0.1040.4
20.4800.10530.4810.10540.4830.10550.4840.1056
0.483
0.105
2.3.2.2 中间精密度
中间精密度结果见表5，由结果可知，2名操作人员12个结果中保留时间和吐温80含量的RSD 值分别为0.4%和2.2%，说明该方法的精密度良好。2.3.3 准确度
准确度试验结果见表6，结果表明3个浓度水
平的样品回收率分别为105%、98%和108%，在90%~110%，说明该方法的准确度较高。2.3.4 线性和范围
线性试验结果如表7所示，结果表明在0.025~0.800 mg/mL 范围内，吐温80含量和峰面积线性关系良好，标准曲线为Y =2×108X -4×106，线性相关系数R 2为0.999 1。由以上结果可知，符合重复性、
0.1 mg/mL吐温80标准品
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
1.10
1.20
1.30
1.40
1.50
1.60
1.70
1.80
1.90
2.00
2.10
2.20
2.30
2.40
2.50
2.60
2.70
2.80
2.90
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
3.203.002.802.602.402.202.001.801.601.401.201.00
1.25
1.201.151.101.051.000.950.850.80蟑螂之歌
1234567
m
注：1-5：蛋白浓度分别为60 mg/mL、50 mg/mL、40 mg/mL、30 mg/mL、20 mg/mL；6：稀释缓冲液；7：超纯水
图1 蛋白干扰试验
供试品
和平县论坛3.803.603.403.203.002.802.602.402.202.001.801.601.401.20
0.1 mg/mL吐温80标准品
阴性对照
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80麦克米伦缺口
0.90
1.00
1.10
1.20
1.30
1.40
1.50
1.60
1.70
1.80
1.90
2.00
2.10
2.20
2.30
2.40
2.50
2.60
2.70
2.80
2.90
m
稀释缓冲液
图2 专属性试验谱图
表5 中间精密度试验结果
操作人员重复保留时间/min RSD /%
吐温80含量/
（mg/mL）RSD /%
操作员1
10.4780.4
0.104 2.2
20.4800.10530.4810.10540.4830.10550.4840.10560.4830.105操作员2
10.4820.10120.4830.10030.4840.10140.4790.10150.4840.1006
0.482
0.100
第1期·35·张博慧等：高效液相谱-荧光检测器法检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量
准确度和线性的检测范围为0.05~0.80 mg/mL。
2.3.5耐用性
2.3.5.1样品稳定性
样品稳定性试验结果见表8，结果表明样品在仪器样品储藏室（2~8 ℃）中放置8 h、24 h和48 h后，吐温80含量与0 h的相对差值分别为3.0%、4.0%和1.0%，说明样品在仪器样品储藏室内放置48 h后对检测结果几乎无影响。
表8样品稳定性试验结果
样品放置时间吐温80含量/（mg/mL）相对差值/%
0 h0.100
8 h0.103 3.0
24 h0.104 4.0
48 h0.099 1.02.3.5.2反应线圈批次
反应线圈批次试验结果见表9，结果表明应用不同批次的反应线圈的相对差值为3.3%，说明反应线圈批次对检测结果无影响。
表9反应线圈批次试验结果
反应线圈
批次
重复
吐温80含量/
（mg/mL）
含量平均值/
（mg/mL）
相对差值/%批次1
10.108
0.108
3.3
20.108
30.110
40.108
50.108
60.108
批次2
10.104
0.105
20.105
30.105
40.105
50.105
60.105
2.4方法适用性研究
应用本方法对6种单克隆抗体注射液进行吐温80含量的检测，检测结果见表10。结果显示实测值与理论值的偏差介于0%~15%，准确度较高。
广州双食记表10方法适用性研究结果
样品名称
蛋白含量/
（mg/mL）
吐温80含量/（mg/mL）偏差/
%
标示值实测值平均值单抗1
（批号
BC006S191127）
200.1
0.09
0.0910
0.09
0.09
单抗2
（批号
LDS20170806）
200.1
0.10
0.100
0.10
0.10
单抗3
（CDP120180508）
50.1
0.09
0.0910
0.09
平湖十八楼
0.09
Humira
（批号
213089A07）
50 1.0
0.92
0.955
0.97
0.97
Opdivo
（批号
AAC8975）
100.2
0.17
0.1715
0.17
0.17
Erbitux
（批号257094）
50.1
0.09
0.0910
0.09
0.09
表6准确度试验结果
浓度水平/（mg/mL）重复
实测值/（mg/mL）理论值/
（mg/mL）
回收率
/%吐温80含量平均值
0.810.838
0.8370.80105 20.834
30.840
0.110.100
0.0980.1098 20.096
30.098
0.0510.055
0.0540.05108 20.053
30.054
表7线性试验结果
吐温80浓度水平/（mg/mL）峰面积峰面积平均值
0.0251 445 647
1 476 728 1 471 154
1 513 383
0.0504 595 649
4 614 110 4 59
5 551
4 651 131
0.10011 090 722
11 151 455 11 183 631
什么是企业精神11 180 012
0.20026 141 868
26 155 969 26 146 408
26 179 631
0.40058 434 504
58 488 238 58 453 614
58 576 595
0.800125 498 340
125 488 131 125 530 113
125 435 939
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