食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期17
3种五环三祜酸
张萍，何婷，王颖，胡克特，顾丁，陈荣祥**
(遵义医科大学基础医学院，贵州遵义563000)
摘要：目的建立加速溶剂萃取-超高效液相谱-串联质谱法(ASE-UPLC-MS/MS)同时测定大枣中桦木酸、齐墩果酸和熊果酸的方法。方法样品釆用ASE提取，优化提取条件，并与超声辅助提取法进行比较。优化 后的提取条件为：以80%甲醇为提取溶剂，提取温度100-C，静态萃取时间15min，萃取1次。提取液釆用Waters ACQUITY BEH C18谱柱分离，以乙ffi-15mmol/L乙酸钱(pH9.3)为流动相，梯度洗脱，经UPLC-MSZMS仪，釆用电喷雾电离源，负离子模式下多反应监测模式检测。结果桦木酸、齐墩果酸、熊果酸在0.5~10 mg/L范围内，浓度与峰面积线性关系良好，相关系数大于0.9900。不同浓度3种化合物的加标回收率93.6%〜101.7%，相对标准偏差在1.18%~6.83%之间。结论此法简单快速、准确稳定、重复性好，可用于大枣中桦木酸、齐墩果酸、熊果酸的含量测定。 关键词：加速溶剂萃取；超高效液相谱；串联质谱法；大枣
中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2021)01-0017-06
DOI：10.3969/j.issn.l672-979X.2021.01.004
Simultaneous Determination of Three Pentacyclic Triterpenic Acids in Jujubae Fructus by
Accelerated Solvent Extraction-UPLC-MS/MS
ZHANG Ping,HE Ting,WANG Ying,HU Ke-te,GU Ding,CHEN Rong-xiang
(School of B asic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zu^yi563000,China)
Abstract:Objective To establish a method for the simultaneous determination of betulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid in Jujubae fructus by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)with accelerated solvent extraction(ASE).Methods The extract parameters of A SE were optimized and the efficiency was compared with the ultrasound-assisted extraction method.The optimum extraction conditions were as follows:80%methanol was selected as extraction solvent,oven temperature was100°C,the static extraction time was 15min and one extraction cycle was adopted.A waters ACQUITY BEH C18(2.1mmx]00mn,1.7“m)column was used as the stationary phase,acetonitrile and ammonium acet
ate solution(15mmol/L,pH9.3)was used as the mobile phase.Mass detection was conducted by electrospray ionization in negative ion multiple reaction monitoring mode. Results The calibration curves were linear over a concentration range of0.5-10mg/L for betulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid.The correlation coefficients were greater than0.9900.The recoveries of different spiked levels were between93.6%and101.7%,with RSDs between1.18%and6.83%.Conclusion The method is simple,rapid,
收稿日期：2020-09-04
基金项目：国家自然科学基金(31660131,81760652)；贵州省联合基金(黔科合J字LKZ[2013]17号)；遵义医学院博士启动基金(F-568)
作者简介：张萍，硕士研究生，研究方向：药用植物开发与利用E-mail:*****************
*通讯作者：陈荣祥，教授，博士，研究方向：药用植物开发与利用E-mail:*************************
18食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期
accurate,stable and reproducible.It can be used for the determination of betulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid in Jujubae f ructus.
Key Words:accelerated solvent extraction;ultra-high performance liquid chromatography;tandem mass spectrometry; Jujubae f ructus.
大枣为鼠李科植物枣树（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果实，不仅作为食物，还是传统中医药中的常用药材。大枣富含氨基酸、多糖、三菇酸、环核昔酸和黄酮类化合物，有抗过敏、抗肿瘤、镇静、保肝、抗炎、抗氧化等药理作用21。研究表明，五环三菇酸是大枣的主要活性成分之一，主要包括齐墩果酸、熊果酸、桦木酸等冈。现代药理研究发现，枣中桦木酸、齐墩果酸和熊果酸对多种疾病有作用。齐墩果酸有抑制细菌生长、降低血脂、保肝、增强免疫力等生理功能旳。熊果酸有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、保肝、降血糖作用冏。桦木酸有显著的抗肿瘤和抗病毒作用，及抗炎、抗糖尿病、抗高血脂等药理作用同。因此，研究大枣中五环三话酸的含量和组成对其质量控制有积极意义。
加速溶剂萃取法（ASE）是一种利用传统的液体溶剂在高温高压下提取化合物的自动化提取技术，有回收率高、速度快、溶剂用量少等优点叫在萃取复杂体系中化合物方面有一定优势，可用于提取食品、药品中的多环芳烧、无机离子和药物残留等阴現有文献网证明采用ASE萃取中草药中的齐墩果酸和熊果酸的提取效率优于超声提取法。但目前尚未见大枣中多种五环三菇酸的的ASE提取相关报道。
目前，植物源五环三菇酸的检测方法主要采用高效液相谱法，紫外检测器/二极管阵列检测器［15-16\蒸发光散射检测器旳、串联质谱（MS/ MS）检测器㈣等均可用于检测“如。五环三菇酸最大吸收波
长在200nm附近，但干扰严重，响应较低，对于含量较高的中草药可直接测定，而对低含量的样品灵敏度不足，如大枣、赤芍中的五环
-液萃取、离子液体萃取等方式加以富集j”］。相对于光学检测器，MS/MS灵敏度高，与超高液相谱法（UPLC）联用可进一步缩短分离时间、提高灵敏度。研究表明，采用UPLC 可将齐墩果酸和熊果酸的分离时间由20~40min缩短至约10min123'24^本研究拟采用ASE从大枣中提取齐墩果酸、熊果酸和桦木酸（化学结构式见图1），用UPLC分离，MS/MS进行检测，为筛选优质品种枣和开发大枣保健功能食品提供技术支持。
图1齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的化学结构式1仪器与材料
1.1仪器
ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S超高效液相谱串联三重四极杆质谱仪，MassLynx V.4.1工作站软件控制（美国Waters公司）；ASE-350型加速溶剂萃取仪（配有34ml不锈钢萃取池，赛默飞世尔科技公司）；SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ME104E电子天平, FE28pH计［梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司］;PURELAB Chorus2纯水及超纯水系统（英国埃尔格）；microfuge20离心机（德国贝克曼）；
y
1.2材料
乙睛（质谱纯，霍尼韦尔贸易有限公司）；齐墩果酸对照品（批号E1525063，纯度大于97%），熊果酸标准品（批号L1411037，纯度大于98%），甲醇、氨水、乙酸镀为谱纯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；桦木酸对照品（批号AMW002，纯度大于97%,ArkPharm）；硅藻土（赛默飞世尔科技公司）。其他试剂均为分析级。大枣购自当地市场。
2方法与结果
2.1含量测定
2.1.1彳
烘干后粉碎过60目筛，精密称取粉碎均匀的试样0.5g，加入硅藻土混合均匀，装入34ml萃取池中
食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期19
进行萃取。萃取条件：提取溶剂80%甲醇水溶液,
萃取温度100°C，压力1500psi，循环1次，静态萃
取时间15min，冲洗体积为提取池体积50%。氮气
吹扫60s。收集全部提取液于量瓶中，并定容至100
ml,10000r/min离心10min后过0.22“m尼龙滤膜即
得。
2.1.2对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸、熊
果酸、桦木酸的对照品，用甲醇溶解并定容于10
ml量瓶中，配制成浓度为1mg/ml的对照品储备液。
使用时，根据需要移取对照品储备液适量，以甲醇
稀释，配制成系列质量浓度的混合对照品工作液。
2.1.3液相谱条件分析谱柱：Waters Acquity
UPLC BEH Cm柱（2.1mm MOO mn, 1.7“m）；流
动相A相：乙膳；Bffl：15mmoLZL乙酸镀溶液（氨
水调节pH9.3），采用梯度洗脱，0〜4min,75%
A,4〜5min为75%A~95%A,5〜6.5min为95%A,
6.5〜7min为95%A-»75%A，体积流量0.2ml/min,
柱温359，进样量1“1。
2.1.4力
式下多反应监测（MRM）检测。毛细管电压：3.5
kV：蒸发温度6009；气流量：750L/ho进一步对
锥孔电压、碰撞能量等进行优化，结果见表1。
表13种化合物质谱参数
组分前体离子
m/z
产物离子
m/z
锥孔电压
/V
碰撞能量
/eV
桦木酸455.5455.54045
齐墩果酸455.5407.53938
熊果酸455.5407.53938
2.2提取条件的优化
2.2.1ASE条件的优化ASE的提取效率主要取决于提取溶剂的种类、提取温度、提取次数和静态提取时间。本研究中，所有提取均在1500psi下进行，提取池的冲洗体积为50%，用氮气吹扫60So
2.2.2扌
考察不同体积分数的甲醇对3种组分提取效果的影响（见图2）。结果表明，当甲醇体积分数为80%时，3个组分的提取效率均达到最高。当甲醇体积分数大于80%，提取率下降，因此可确定甲醇的体积分数为80%。
佃
JOT
300
200
iCX'i
........帳貝檢
50M S090
图2甲醇体积分数对于提取效率的影响
2.2.3提取温度的优化温度是影响提取回收率的重要因素，本实验考察了不同温度（60,80,100, 110,120°C）对3种组分提取效率的影响（见图3）o结果表明，100°C时3组分的提取率最高，超过100°C时，提取效率逐渐降低，因此，可确定提取温度为100°C o
_44）叶
树加m孙1怕im|少
军取沮度e
图3温度对于提取效率的影响
2.2.4提取时间的优化 采用80%甲醇在100£下考察不同提取时间（静态提取3,10,15,20,30 min）对3组分提取效率的影响（图4）。结果表明, 15〜20mill时，3组分的提取率最髙。因此，选择提取时间为15min。
5IW
JUQ
'-齐墩黒酿2U0
待1525対
康取时
图4
提取时间对于提取效率的影响
20食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期
2.2.5
对3种组分提取效果的影响（见图5）o结果表明,
提取1~3次时，3种组分峰面积基本保持不变，为
了减少提取时间，节省溶剂，选择提取次数为1
次。
500
400 30Q 20C'
……------------齐期果鶴
熊果醱.--------一-------------桦桶k.I,I___
I25
箱年次数，钦
图5提取次数对于提取效率的影响
表2线性方程与范围、检出限结果组分
线性范围标准相关LOD
/mg-L-1曲线系数/yg-L'1齐墩果酸0.5〜10y x0.998613
熊果酸0.5〜10尸1030.1x・105.080.993442
桦木酸0.5-10尸5250.2x241.40.996754 2.3.2加标回收试验精确称取已测得含量的大枣样品0.5g，分别准确加入一定量的对照品，根据优化的提取条件对加标样品进行处理，并在相同的谱条件下进行分析，将测得的峰面积代入回归方程计算各化合物的含量，并计算回收率，结果见表3。齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的回收率分别为98.4%〜101.3%,97.3%〜101.7%,93.6%~96.1%, RSD分别为1.18%〜5.30%, 4.79%~6.83%, 2.50%~6.19%之间，表明回收率良好。
2.2.6谱条件优化采用UPLC EBH久柱（2.1
mmxlOOmm, 1.7ym）为固定相，考察乙酸镀水溶液pH值（氨水浓度调节pH7〜10）对分离的影响。结果表明，当流动相的pH>9时，3种分析物的响应更强，分离度更好。最终选择乙膳和乙酸钱（15mmol/L,pH9.3）为流动相。
2.2.7Esift
酸、熊果酸和桦木酸的对照品溶液，浓度为300yg/ Lo在全扫描模式下选择前体离子，在负电离模式下优化锥孔电压。然后在产物离子扫描模式下选择产物离子，在MRM模式下优化了各产物离子的碰撞能量。优化的前体离子、产物离子和碰撞能量参数见表1。
2.3方法学考察
2.3.1线性方程、相关系数和检出限精密称取齐墩果酸、熊果酸、桦木酸对照品适量，配成混合对照品溶液，在同一谱条件下进样，确定标准物质的保留时间，然后各取一定体积配成不同浓度的混合对照品溶液，进样量1yl，记录谱图，以峰面积对浓度（mg/L）进行线性回归，3种化合物的线性范围、回归方程、相关系数及检出限见表2。齐墩果酸、熊果酸、桦木酸在0.5〜10mg/L浓度范围内，线性关系良好。3种分析物的信噪比为3时的LOD分别为54,13,42y S
L
I*1$
f/min
齐眾墨嚴
343
f/min
图63种对照品（A）和样品（B）化合物的
谱图
u榊
--455.5
食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期21表3加标回收试验结果
组分基础值加标量测得值回收率RSD /mg-kg-1/mg-kg-1/mg-kg-1/%/%
齐墩果酸379.4±15.6150528.2±22.099.2±6.8 6.83
300671.3±29.797.3±4.9 5.08
600989.7±43.7101.7±4.9 4.79熊果酸371.1±18.1200563.2±26.896.1±5.9 6.19
400754.3±26.395.8±2.4 2.50
8001120.1±31.893.6±4.5 4.82桦木酸530.9±22.8300834.7±24.7101.3±1.2 1.18
6001139.0±47.7101.3±4.9 4.86
12001712.2±73.398.4±5.2 5.30 2.4基质效应
基质效应是指从基质中洗脱的其他组分对ESI 源的影响，在电离过程中会对目标化合物产生抑制或增强作用，从而影响检测的准确度和检出限。本文比较了在基质和空白溶剂中制备标准曲线的斜率，以评价基质效应。以大枣提取物为原料，制备了0.5,1>2,5,10mg/L系列基质匹配溶液。计算方法如下：基质效应(％)=基质匹配样品溶液的平均斜率/标准溶液(甲醇配制)的平均斜率x100%。结果表明：齐墩
果酸、熊果酸和桦木酸的基质效应分别为98.61%,92.67%,95.82%，样品与溶剂之间无显著的基质效应。
2.5样品测定
根据优化后的ASE条件处理样品，得供试品溶液，利用质谱进样分析，计算结果见表4。
表4样品含量测定结果/mg・kg-i
组分齐墩果酸含量
/mg-kg'1
熊果酸含量
/mg-kg'1
桦木酸含量
/mg-kg-1
1272.9319.5645.8
2303.7230.1983.7
3863.7668.8730.2
4976.8639.0800.6
5520.0830.9413.5
6837.7509.9609.4
7613.8548.7582.2
8724.3590.3688.4
2.6ASE与超声提取的比较
本研究比较了ASE和超声辅助提取宙对大枣中齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的提取效率，结果见表5。ASE提取大枣中齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的含量优于超声辅助提取法。因此，ASE更适于枣中五环三话酸的提取。
表5ASE与超声提取效果比较
方法安塞县高级中学
齐墩果酸含量熊果酸含量桦木酸含量
/mg-kg1/mg-kg'1/mg-kg'1超声646.3586.4576.1
ASE680.6609.3717.1
3结论
本研究建立了一种基于ASE-UPLC-MS/MS测定大枣中齐墩果酸、熊果酸和桦木酸含量的方法。与超声辅助提取相比，该提取方法更有效，自动化程度更高。采用弱碱性流动相和UPLC谱柱，在5min内分离出3种化合物，与其他谱方法相比，大大缩短了分析时间且灵敏度显著高于液相谱法。本方法简便、快速、准确、可靠，适用于大枣中齐墩果酸和熊果酸、桦木酸的同时测定。
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22食品与药品 Food and Drug 2021年第23卷第1期
顶空气相谱法测定奥贝胆酸原料药中有机溶剂的残留量
付丙月打吴伟山2，张宁打王金虎1*
*收稿日期：2020-05-29
基金项目：山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY010520)
佩特雷斯库作者简介：付丙月，主管药师，从事新药研发和药物分析Tel: 81213293 E-mail: *********************
*通讯作者：王金虎，副主任药师，从事药物分析Tel: 81213293 E-mail: ***************
(1.山东省药学科学院山东省化学药物重点实验室，山东济南250101； 2山东中医药大学附属医院骨科,
山东济南250101)
摘要：目的建立同时测定奥贝胆酸原料药中甲醇、乙醇、异丙醇、乙睛、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四
氢咲喃、三乙胺、甲苯10种有机溶剂残留量的方法。方法采用顶空气相谱法。以Agilent DB-624^细管柱为
谱柱，经程序升温，采用氢火焰离子化检测器，外标法计算溶剂残留量。结果在此谱条件下，甲醇、乙
醇、异丙醇、乙騰、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢咲喃、三乙胺、甲苯10种待测有机残留溶剂的分离 度均大于2.0，线性、准确度、精密度良好，9批样品中10种有机溶剂残留均符合要求。结论经方法学验证，
该方法操作简单，重复性好，准确度高，适用于奥贝胆酸原料药中10中有机溶剂残留的同时测定。关键词：奥贝胆酸；气相谱法；顶空进样；有机溶剂残留
中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1672-979X (2021) 01-0022-07
DOI : 10.3969/j.issn.l672-979X.2021.01.005
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