实验一液质联用分析
一、实验目的
2. 了解、熟悉质谱基本操作技术及质谱检测器的基本组成及原理。
3. 了解采集方法的编辑，掌握LC各模块和QQQ采集参数优化及设置。
李尙福 国防科技大学
4. 熟悉定性分析软件，能从所得的质谱图中指认出相应物质对应的质荷比，能对谱图做定性的描述。
二、实验原理
1. 液相谱-质谱联用（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）
液相谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，已成为一种重要的现代分离分析技术。谱分析是运用物种在固定相和流动相两相间的分配系数不同而达到分离的效果的一种分离技术，主要目的是对混合物中目标产物进行分离和定量的一种分析技术。质谱是通过测定样品的质荷
比来进行分析的一种方法。通过液-质谱联用(LC-MS)技术可实现样品的分离和定量分析，达到快速灵敏的效果。
液质联用系统包括HPLC（谱分离）、液质接口（样品引入）、离子源（离子化）、质量分析器、检测器（离子检测）和真空系统等。 本实验采用ESI离子源的三重四级杆质量分析器（如图1，Q1-质量分析器；Q2-碰撞室；Q3-质量分析器）为低分辨率质量分析器，其质量分析器由四根棒状电极组成，形成一个四极电场，该电场只允许一种质荷比的离子通过，通过四极杆的离子到达检测器被检测，其余离子则振幅不断增大，最后碰到四极杆而被吸收。质谱仪的检测主要使用电子倍增器，由四极杆出来的离子打到高能打拿极产生电子，电子经电子倍增器产生电信号，记录不同离子的信号即得质谱。
图1三重串联四极杆质谱的系统结构图示意图两个四极杆在空间上串联起来，在分析测试的模式上多了以下选择：
子离子扫描（Product Ion Scan）：MS1 使用SIM 方式选择某一个或多个特定质荷比的母离子通过四极杆1，在碰撞池施加碰撞能量产生碎片离子，然后在四级
杆2中进行扫描分析。此过程可以产生典型的质谱/质谱碎片谱图。三重串联四极杆通过这种工作方式可以得到待分析物质的二级质谱图，从而帮助确定在做多反应监测时使用的定量离子和定性离子。
母离子扫描(Precursor Ion Scan)：第一个质量分析器扫描电压选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。主要用于同系物的分析。实例：（Q1 = 100-300 m/z；Q3 = 259 m/z）中性丢失扫描(Netural Lost Scan)：第一个质量分析器扫描所有离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数15、18、45）的离子对，得到中性碎片谱，主要用于中性碎片的分析。实例：（Q1 = 100-300 m/z；Q3 = 82-282 m/z）多反应监测(MRM，Multiple Reaction Monitoring)：MS1 采用SIM 方式选择某个或多质荷比的母离子，在碰撞池施加碰撞能量产生碎片离子。MS2 同样采用SIM方式来监测由母离子产生的一个或几个特定子离子。这就是多反应监测（MRM）
。这种方式可以极大提高检测灵敏度和定量准确性，是三重串联四极杆仪器最主要的使用方式。 三、仪器与试剂
Agilent液相谱-三重四级杆质联用仪（LC-MS/MS,1290II-6460）
甲醇（谱纯）；
乙腈（谱纯）；
待测样品：化合物A（正离子模式，m/z=264）；化合物B（正离子模式，m/z=195）。
液相条件：流动相为乙腈和水（含0.1%甲酸和5mM乙酸铵）（40:60），流速
0.3 mL/min，柱温设置为30 °C，进样量5 μL
四、实验内容与步骤
1. 仪器开机。打开仪器开关和计算机电源，仪器从断电状态开机时，打开仪器前面板左下方的电源按键，听到第一次阀切换的声音，真空泵即开始工作，大约2~3分钟后，仪器内置的系统启动完毕，出现第二次阀切换声，双击“MassHunter”软件进入工作站，与仪器通讯，待仪器运转正常（前级真空1~
3 Torr、高真空达到4×10-5 Torr以下），即可进行调谐或开始实验。
2. 系统初始化：（主要目的是排除溶剂管路中气泡）
将液相泵设置为“ON”的状态，在泵模块（Binary Pump）点击鼠标右键，选中“Prepare Pump”，设置泵流量5mL/min、分别冲洗实验所用的A、B两个管路（将其比例分别设为100%），仔细观察废液管，如果没有气泡从废液管中派出则证明该管路冲洗完毕，然后将流动相比例设置成实验所需比例。
3. 仪器调谐：仪器关机时间较长或样品检测结果异常时，建议调谐质谱仪以达到最佳使用状态。确认调谐液存量及其洁净，管线已经连接到喷雾针，进入MassHunter的“Tune”界面，选择适当极性“Positive、Negative或两者均选”，点
击“AutoTune”。调谐完成后自动保存调谐结果并生成调谐报告，调谐通过后，切换回“Acquisition”工作界面。
4. 编辑数据采集方法及数据采集。在MussHunter的采集方法编辑“Method Editor”界面下，通过“Sampler”、“Binary Pump”、“Column Comp”、“QQQ”选项卡分别设定进样量（5 μL）、流动相流速（0.3 mL/min）与组成（乙腈和水（含0.1%甲酸和5mM乙酸铵）：40: 60））、柱温（30 °C）及质谱采集方式。
正离子模式下，分别采用以下方法分析待测溶液：
（1）通过全扫描扫描（MS2 Scan）荷质比范围50-500，扫描时间200 ms，源内碎裂电压60V，确认化学物出峰情况，寻化合物A、B保留时间。
（2）使用选择离子检测（SIM），优化各个化合物的源内碎裂电压Fragmentor(40-140)，母离子（Precursor）分别设置为195和264，子离子MS2分别设置为50-200和50-300，扫描时间（Scan time）100 ms。
（3）子离子扫描（Product Ion）：寻子离子，每个化合物至少到两个子离子，继续做子离子扫描，针对各个子离子优化碰撞电压CE。
5. 利用软件进行数据分析，双击Agilent Masshunter Qualitative Analysis 图标，打开定性分析软件，对上述检测数据进行分析。
6. 实验结束：实验结束后，将质谱仪置于Standby状态，使系统休眠。
仪器关机：如长期不用或有断电通知时，需将仪器关机。选择MassHunter的质谱仪器图标，左键单击、选择Vent，开始放空。放空完毕后（时间在15分钟左右），系统会给出提示，此时方可关闭电源。为避免仪器部件不必要的负荷，对于较长时间关机的仪器，建议将主电源线拔掉。
五、实验结果与分析
1. 利用全扫描方式，得到化合物的质荷比和保留时间分别为：
A：m/z= ; min B：m/z= ; min
2.利用选择离子监测模式，得到化合物的最佳Fragmentor电压分别为：
A：V; B：V
3.利用子离子扫描方式，选择响应最强的两个子离子，它们的m/z和CE分别为：
A子离子1：；最佳CE：V；
子离子2：；最佳CE：V；
B子离子1：；最佳CE：V；
子离子2：；最佳CE：V；
六、注意事项
使用质谱仪器时，建议使用进口分装的谱纯以上级别的有机试剂。水相请使用机制纯净水或新鲜的市售小包装饮用纯净水。水相、缓冲液以及含有有机相不足10%的水溶液，放置超过2天后请及时更换。
下列的溶剂添加会产生离子化抑制，请慎用：三氟乙酸，会影响负离子模式离
子化，并造成该模式下m/z = 113，227，245的污染峰；有机胺类，尤其三乙胺会影响正离子模式离子化，并造成该模式下m/z = 102的污染峰。
下列的溶剂添加剂会产生严重的离子化抑制，建议禁用：强酸强碱、不挥发性酸及相应的盐（如磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、表面活性剂等）。
七、思考题
长沙理工大学网络中心1、各扫描模式中m/z分别如何设定？
2、比较各模式的测定结果，讨论各模式在测定中的作用。大胡子小
3、结合HPLC等其它谱分析技术及实验，讨论LC-MS的优势及在社会中所能起到的作用。
附：仪器设置
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图2 方法编辑、分析工作列表和单针样品分析选项卡
图3 采集方法编辑-自动进样器设置
图4 泵（流动相）设置
图5 质谱采集参数设置（一）图5 质谱采集参数设置（二）图6 质谱采集参数设置（三）
实验二气相谱-质谱联用对挥发性有机物定性检测
一、实验目的
1．了解气相谱-质谱联结构、原理、特点和使用方法。
2．掌握气相谱中质谱库定性的基本原理。
钢管桩3．了解利用弱极性毛细管柱测定非/弱极性有机物的注意事项。
二、基本原理：
2.1 气相谱工作原理
气相谱是利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的样品被载气带入谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，因此各组份在谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的谱峰。
2.2 气相谱仪的组成及作用
气相谱的结构由以下几个系统组成：载气系统，进样系统，谱柱，检测器，记录系统和温度控制系统。
(1) 载气系统：包括气源、气体净化、气体流速控制装置三部分，作用是提供稳定流量/压力的高纯载气。气源提供载气流动相，气体净化装置去除载气中的杂质和水汽，纯化载气，气体流速控制装置可控制载气的流量。
(2) 进样系统：包括注射器和进样口（隔垫、衬管），样品被注射器注入衬管后（液体样品将瞬间汽化），被载气带入谱柱，分流功能也在进样口实现。
(3) 谱柱：谱柱是混合物样品中的各组分分离的场所，是气相谱最重要的结构之一。谱柱按照固定相是固体还是液体有填充柱和毛细管柱两种。
(4) 检测系统：获得与各组分含量呈比例的信号。
(5) 记录系统：包括放大器及记录仪，或数据处理装置及工作站，记录检测器获得的信号，得到谱图，并可以对谱峰进行积分等处理。
(6) 温度控制系统：柱温箱的主要作用是控制柱室和气化室的温度。在恒温或程序升温控制下，样品中各组分在谱柱上实现分离。
2.3 质谱检测器的工作原理
质谱仪主要由离子源、质量分析器、检测器、真空系统组成。离子源是质谱仪的核心，其作用是将被测样品分子电离成带电的离子，并对离子加速使其进入质量分析器。质量分析器的作用是将离子源产生的离子按照荷质比的大小分开并排列成谱图。检测器的作用是对离子进行记录并转换成电信号放大输出，输出的信号经过计算机采集和处理，最终得到按m/z大小排列的质谱图。真空系统的作用是提供真空环境，保证离子源中灯丝的正常工作，保证离子在离子源和分析器中的正常运行，减消不必要的离子碰撞，散射效应，复合反应和离子-分子反应，减小本底与记忆
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