加菲，⽣物制药⾏业从业近10年，从今天开始，将在赛默飞⽣物⼯艺平台为⼤家带来系列栏⽬—— 《加菲说检测》，将聚焦于⽀原体和⽀原体检测。
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⽀原体污染是⽣物制药⾏业⽆法回避的话题，在产品研发和⽣产中，⽀原体污染对产品质量和患者安全都存在潜在威胁，各国法规都规定：源于细胞培养的产品都必须确保⽆⽀原体污染，并提供了相应的检测指南，污染监测显然是⽣物制品安全性的重要保障措施之⼀。 在2015年版的《中国药典》中推荐了培养法和染⾊法，并强调可以采⽤国家药品检定机构认可的其他⽅法 [1]。⾃2003年以来，国内⽣物制品⽀原体污染率虽然有所下降[2]，但是部分⽀原体如猪⿐⽀原体仍难以通过培养法完全检测出来[3]，这也是培养法⽬前遇到的主要挑战之⼀。 其次，培养法和染⾊法作为经典⽅法，其综合成本⾼、检测时间长，因此不适合⽤于在线监测。对于效期较短的单剂量或低剂量产品，如细胞或基因产品，28天培养⽅法就显得⼒不从⼼。因此使⽤⼀种快速、灵敏、准确的⽅法就迫在眉睫了。
美国药典，欧洲药典和⽇本药典相应的章节都推荐了核酸扩增⽅法（NAT）⽤于⽀原体检测，并且在经过适当验证之后可以替代28天培养法，⽤于过程控制，或放⾏检测。⽬前已经有多个上市产品使⽤了Thermo Fisher ⽀原体检测试剂盒MycoSEQ进⾏放⾏检测（表1），⽐如诺华上市的第⼀个细胞药物。
表1. 欧美多个上市产品使⽤MycoSEQ进⾏放⾏检测
就⽬前形势看来，现有药典⽅法并不能满⾜快速在线检测和新型产品的放⾏要求，因此很多研发者更倾向采⽤快检⽅法，⽤于当前⽅法的补充或替代。相关部门 “ ⿎励研究者开发快速的⽀原体检查法，⽤于中间过程监测或放⾏检测，但在临床试验过程中必须对快速⽅法进⾏充分的验证，验证⽅法可参考中国药典的相关规定及国际要求，证明所⽤快速⽅法的最低检出限⾄少不能低于药典⽅法” [4]。 傅汉思
大律师巴布关于如何对核酸扩增⽅法进⾏验证，主要参考欧洲药典2.6.7，包括特异性（Specificity）、最低检出限（Detection Limit）和耐⽤性（Robustness）和与药典⽅法的可⽐性研究（Comparability）。如果使⽤商品化试剂盒，则需要⽣产商提供完整的⽅法学验证数据 [5]。随着国际法规的变化和⾏业的需求，我国药典已将增订⽀原体核酸扩增⽅法列⼊⼯作计划 [2]，并在2019年药典委“第⼆届中⽇药典专题研讨会”上，提到了新版药典通则⽀原体检测新增第三法 [6]。
在这⾥推荐⼀种⽀原体快速检测⽅法——来⾃于赛默飞的⽀原体检测试剂盒MycoSEQ，符合法规要求和国内⾏业标准，灵敏度⾼，准确性好，可在5⼩时内提供结果，实现实时在线监测功能并满⾜放⾏检测要求。纽卡斯尔 西塞
图2. Thermo Fisher MycoSEQ⽀原体检测系统
MycoSEQ试剂盒特点如下：
•集成31条引物以保证＞90种⽀原体的覆盖率，包括常见污染和药典要求验证的⽀原体种类；
•能够达到药典要求的替代28天培养法的灵敏度要求（10CFU/mL）和专属性要求；
•使⽤了特殊的阳性对照（DPC）⽤于防⽌假阳性和假阴性（图3）；
•该试剂盒搭配prepSEQ样品制备试剂盒，能够快速有效提取基因组DNA，保证回收效果，并可以实现⾃动化样品制备；
•FDA和EMEA等批准⽤于⽀原体放⾏检测，有FDA备案信息。
图3. 试剂盒阳性对照与阳性⽀原体融解曲线对⽐（有效防⽌假阳性和监测提取效果）
数控技术
这只是个开始，后续我们会持续聊到⽀原体那些事⼉和⽀原体检测那些事⼉，欢迎⼤家继续收听！Sta
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2020/3/18-3/20 24:00
*本活动最终解释权归赛默飞世尔科技（中国）有限公司所有。
参考⽂献：
cnn1. 《中国药典》2015年版（三部）通则-3301⽀原体检查法
2. 赵翔, 冯建平, 孟淑芳. ⽀原体检查的核酸检测⽅法及⽅法学验证的思考[J].中国药事 2018, 32 (7):1020-1027.
3. 赵翔，寿成超，袁宝珠等.中国⽣产⽤细胞基质污染⽀原体类型的分析及猪⿐⽀原体特异性检测⽅法的初步建⽴[J]. 中国⽣物制品学杂志 ,2015,28(8):832-836,840.
4. 吴雪伶，赵翔，孟淑芳. CAR-T细胞产品质量控制检测研究及⾮临床研究考虑要点[J]. 中国药事,2018,32(7):879-88
5.
5. European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia[S]. 9th Edition, 2017: Section 2.
6.通古斯人
7.
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