07/2016:20246
2.2.46. 谱分离技术
谱分离技术是样品组分在流动相和固定相两相中分布的多级分离方法。固定相可能是由固体或凝胶承载的固体或液体。固定相可以填充在一柱子内，或分散成一层，或分布成一层薄膜等。流动相可以是气体或液体或超临界流体。分离可能是基于吸收、质量分布（分配）、离子交换等，或者基于分子理化特性的不同，诸如分子的大小、质量、体积等。 本文包含了常用参数的定义和计算及系统适用性通常适用的要求。分离的原理、装置和方法在下列通用方法中给出： —纸谱（2.2.26）；
—薄层谱（2.2.27）；
—气相谱（2.2.28）；
—液相谱（2.2.29）；
—尺寸排阻谱（2.2.30）；
—超临界流体谱（2.2.45）。
定义
各论中的系统适用性和可接受标准已经用下文定义的参数设置。对于某些设备的某些参数，例如信噪比和分离度，可由设备制造商提供的软件计算。使用者有责任确保该软件的计算方法与欧洲药典的要求相当，如果不是这样，进行必要的修正。
谱图血凝试验
检测器响应、流出液浓度或用于测量流出液浓度的其他数量对时间或体积的一种图解或其他的表示方法。理想的谱图被描述成是基线上高斯峰的序列（图 2.2.46.-1）。
峰
当某一单一组分（或者2或更多未分离的组分）从谱柱被洗脱出来时，谱图中记录检测器响应的部分。
谱峰可用下列参数定义，峰面积或峰高（h）及半峰高处的峰宽（w h）或峰高（h）及拐点之间的峰宽（w i）。在高斯峰中（图2.2.46.-1），有下列关系：
w h = 1.18w i
洗脱出某一组分所需的时间（图2.2.46.-1，基线刻度以分钟表示）
保留体积（V R）
洗脱出某一组分所需的流动相体积。可使用下面公式，通过保留时间和流速（F），单位毫升每分钟，来计算：
V R=t R×F
滞留时间（t M）
洗脱出非保留组分所需的时间（图2.2.46.-1，基线刻度以分钟表示）。尺寸排阻
谱中使用符号t0表示（见下文）。
滞留体积（V M）
洗脱出非保留组分所需的流动相体积。可使用下面公式，通过滞留时间和流速（F），单位毫升每分钟，来计算：
V M= t M×F
尺寸排阻谱中使用符号V0表示（见下文）。
图2.2.46.-1
保留因子（k）
按下式定义保留因子（亦即质量分布比率(D m)或容积因子(kˊ)）：
K C = 分配常数（亦即平衡分布系数）； V S = 固定相体积； V M = 流动相体积。
可用下列公式从谱图中确定某一组分的保留因子：
总流动相时间（t t ）
三棱豆
尺寸排阻谱中，分子比最小凝胶孔径还小的组分的保留时间（图2.2.46.-2）。 总流动相体积（V t ）
尺寸排阻谱中，分子比最小凝胶孔径还小的组分的保留体积。可使用下面公式，通过总流动相时间和流速（F ），单位毫升每分钟，来计算：
V t = t t × F
图2.2.46.-2
非保留化合物的保留时间（t 0）
尺寸排阻谱中，分子比最大凝胶孔径还大的组分的保留时间（图2.2.46.-2）。 非保留化合物的保留时间（V 0）
尺寸排阻谱中，分子比最大凝胶孔径还大的组分的保留体积，使用下面公式，
正交试验
M
S
C V V K ==
流动相中组分的数量固定相中组分的数量k M
M
R t t t k -=
通过总流动相时间和流速（F ），毫升每分钟，来计算：
步行速度V 0 = t 0 × F
分配常数（K 0）
尺寸排阻谱中，特定的柱子中的某一组分的洗脱特性可通过分配常数给出（也称为分配系数），可用下列公式计算：
滞留因子（R F ）
用于平面谱的滞留因子（亦即保留因子（R f ））是指点样点至斑点中心的距离与前端溶剂从点样点处迁移的距离的比率（图2.2.46.-3）。
b = 组分的迁移距离； a = 前端溶剂的迁移距离。
A 前端流动相
B 斑点
C 起始点样线
图2.2.46.-3
塔板数（N ）
柱效（表观效率）可通过要么在等温、等梯度条件下，要么在等密度条件下（取决于技术的不同）获得的数据计算得到，该数据以塔板数，
亦称为理论塔板数来
0t t t t K t R --=
a
b
R F =
表示。用下列公式计算塔板数，t R 和W h 的值用同一单位表示：
t R = 组分对应峰的保留时间； W h = 半峰高处的峰宽。
塔板数因组分的不同而不同，也会因谱柱、柱温、流动相和保留时间的不同而不同。 滞留体积（D ）
滞留体积（亦即梯度滞后体积）是指洗脱液交汇的点至谱柱顶端之间的体积，可用下列程序测定。
柱子：用一根合适的毛细管柱（例如，1m ×0.12mm ）代替谱柱。 流动相：
— 流动相A ：水R ；
— 流动相B ：0.1%（V/V ）丙酮R 溶液；
时间 （min ） 流动相A （%，V/V ） 流动相B （%，V/V ） 0—20 100→0 0→100 20—30林兆华
100
流速：设置流速以获取足够的反压（例如，2ml/min ）。 检测：265nm 处分光光度法检测
测定当吸光值增加了50%时的时间（t 0.5），单位min （图2.2.46.-4）八角楼上
t D = t 0.5－0.5t G （min ）；
t G = 预定义梯度时间（=20min ）； F = 流速（mL/min ）。
2
54.5⎪
⎪⎭
⎫
⎝⎛=h R W t N F
t D D ⨯=
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