生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ
·综述与专论·
２００６年第４期
收稿日期：２００６－０４－２８
基金项目：国家９７３基础研究项目（２００６ＣＢ１００１０２）、国家自然科学基金项目（３０５４００６５）和云南省烟草公司科研技术开发项目作者简介：李文正（１９６７－），男，博士，研究方向为抗逆分子生物学通讯作者：张海文，；Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｈａｉｗｅｎ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
ＥＲＦ转录因子及其在烟草抗逆性改良中的应用
李文正１
张海文２，３王俊英２，３黄荣峰２，３
（
１
云南省烟草科学研究所，玉溪６５３１００，２中国农业科学院生物技术研究所，北京
１０００８１；
３
１０００８１）
摘要：转录因子调控的基因表达是植物逆境应答反应的关键环节。乙烯反应因子（ＥＲＦ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒ） 在植物抗逆反应中发挥重要的调控作用，并成为近年来植物分子生物学领域的研究前沿。本文综述目前ＥＲＦ及其对烟草抗逆遗传改良的相关研究进展。
关键词：
乙烯应答因子
烟草
抗逆性
遗传改良
ＥｔｈｙｌｅｎｅＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅＦａｃｔｏｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎ
ＩｍｐｒｏｖｉｎｇＴｏｂａｃｃｏＴｏｌｅｒａｎｃｅｔｏＢｉｏｔｉｃａｎｄＡｂｉｏｔｉｃＳｔｒｅｓｓｅｓ
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２
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３
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｐｌａｙｃｒｕｃｉａｌｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｔｏａｄｖｅｒｓｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒｓ
（ＥＲＦｓ）ａｒｅｅｖｉｄｅｎｃｅｄｔｏｈａｖｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｐｌａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｖａｒｉｏｕｓｓｔｒｅｓｓｅｓ，ｗｈｉｃｈｈａｖｅ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｓｔｒｏｎｇｉｎｔｅｒｅｓｔｏｆｐｌａｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｍａｉｎｌｙｄｉｓｃｕｓｓｅｓｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｉｎｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒｓＴｏｂａｃｃｏＤｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅＧｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ
前列舒安植物的生长发育和对逆境的适应涉及到复杂的基因表达调控网络，尤其是对于干旱、低温和高盐等胁迫的抗逆反应是多基因参与的协同防御反应。在长期的进化过程中植物形成了逆境应答的基因表达模式来适应不同的环境胁迫。研究发现冷害、伤害、干旱、水胁迫、过敏反应、乙烯、脱落酸（Ａ－ＢＡ）、
茉莉酸和水杨酸等因子能有效地诱导多种转录因子基因的表达，预示着转录因子在提高植物抗逆性中发挥重要作用。植物基因组中有很大一部分基因编码转录因子，如拟南芥中约有１５００多种编码转录因子的基因，其中已发现１２２个编码ＥＲＦ因子的基因；水稻中有１３９个编码ＥＲＦ因子的基因［１］。由于转录因子在植物信号传导的建立、基因
表达调控等事件中发挥重要的作用，因此以相关转录因子基因转化植物，可能调控多个下游抗性功能基因的表达，从而获得抗性综合能力得以提高的转基因植株。本文主要综述近年来有关ＥＲＦ及其对烟草抗逆遗传改良应用的相关的研究进展。
１ＥＲＦ是植物生长发育和胁迫应答反应的
氮重要调控因子
乙烯作为一种气体的植物激素，参与种子萌
发、根和茎伸长、花形成、果实成熟及组织程序性死亡等植物发育过程的调节，并且在植物应答机械伤害、病原侵害、低温、干旱、盐碱等胁迫过程中发挥重要作用。植物中乙烯通过其信号转导途径有效地调控体内大量相关功能基因的表达，进而引发一系
２００６年第４期
列生理、生化反应，形成高效有序的乙烯信号调控网络。ＥＩＮ３是乙烯信号传导途径的第一个转录因子，拟南芥ＥＩＮ３能直接特异地结合到ＥＲＦ１上游ＰＥＲＥ（ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅ－ｍｅｎｔ）元件上激活该基因的表达，ＥＲＦ１以级联放大的方式转录激活下游基因表达，在乙烯信号转导和应答反应中发挥重要调控作用［２，３］。
ＥＲＦ是植物特有的一类转录因子，属于ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子亚家族，最初是从烟草中分离出的乙烯应答反应蛋白因子，命名为ＥＲＥＢＰ（ｅｔｈｙ－ｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌ
ｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ），具有一个由５８或５９个氨基酸组成的高度保守、且与ＧＣＣｂｏｘ结合的ＥＲＦ结构域［４］。现已从拟南芥、烟草、水稻、番茄、长春花和小麦等不同植物中分离出大量编码ＥＲＦ蛋白的基因。研究表明烟草ＥＲＦ２／４，拟南芥ＡｔＥＲＦ１／２／５以及番茄Ｐｔｉ４等ＥＲＦ因子在植物中激活相关基因的表达；而ＮｔＥＲＦ３、ＡｔＥＲＦ３／４等起转录抑制因子的作用［５］。此外，还有一些ＥＲＦ家族成员同时兼有活化和抑制结构域，如参与茉莉素信号途径的ＯＲＣＡ３，其Ｎ末端存在一个酸性活化域，而Ｃ末端则具有一个富含丝氨酸的抑制区域［６］。这些研究结果表明ＥＲＦ转录因子对下游基因的调控方式是非常丰富的，这也显示了该家族转录因子在植物生长发育与胁迫应答反应中的重要功能。
ＥＲＦｓ转录因子处在复杂的的信号调控网络中，通过参与不同信号传递网络的交叉对话，参与植物的胁迫应答反应。拟南芥ＣＢＦ１和ＣＢＦ３可以调节ｒｄ２９、ｃｏｒ１５ａ、ｅｒｄ１０、ｒｄ１７、ｋｉｎ１、ｋｉｎ２、ＡＤＳ２、Ｘｅｒｏ２等胁迫应答基因的表达，提高植物对低温的耐性［７，８］；拟南芥ＥＲＦ１可以激活下游基因如含有ＧＣＣ－ｂｏｘ的ＰＲ和不含ＧＣＣ－ｂｏｘ的ＨＬＳ１等的表达，提高拟南芥的抗病性和对非生物胁迫的耐性［２，９］；基因芯片分析表明在拟南芥中至少有２８个基因在Ｐｔｉ４超表达植株中显著表达，这些基因启动子均含有ＧＣＣ－ｂｏｘ或类似ＧＣＣ－ｂｏｘ序列的ＰＲ基因［１０］。拟南芥中超表达番茄Ｐｔｉ４／５／６能够激活ＰＲ１、ＰＲ２、ＰＲ３、ＰＲ４、ＰＤＦ１．２和Ｔｈｉ２．１的表达，表明Ｐｔｉ基因在植物防
卫反应和抗病中起重要作用［１１，１２］。ＤＲＥＢ１Ａ在拟南芥中的超表达强烈地促进ＲＤ２９Ａ的表达，同时也表现出对干旱、高盐和冻害的抗性［１３］。我们的研究发现番茄ＥＲＦ因子ＪＥＲＦｓ在整合乙烯和ＡＢＡ信号途径形成的调控网络中发挥重要作用，而且ＪＥＲＦｓ通过调节植物胁迫相关基因的表达，提高转基植物的耐盐性、耐旱性、耐冷性和抗病性［１４￣１８］。
ＥＲＦ因子对调控植物生长发育与代谢发挥重要的作用，如拟南芥ＥＲＦ因子ＤＲＮ／ＥＳＲ１和玉米ＢＤ１可以调控细胞分生组织的发育［１９，２０］；本实验室的研究也证明ＥＲＦ因子ＴＥＲＦ１和ＴＳＲＦ１能影响种子萌发、幼苗生长和衰老［１４，１７］。长春花ＯＲＣＡ３能提高代谢合成相关基因的表达并增加吲哚类生物碱的积累［６］。番茄Ｐｔｉ４的转基因拟南芥和ＴＥＲＦ１转基因烟草都呈现乙烯过量生成的形态［１０，１５］，表明ＥＲＦ因子可能参与调控乙烯的生物合成。
２ＥＲＦ转录因子基因的表达受多种信号的诱导
大多数转录因子基因的表达受到外界刺激和生长发育进程的诱导，ＥＲＦ基因自身表达也处在复杂的调控途径中，并且参与不同信号途径之间的调控作用。大部分ＥＲＦ基因的表达都受乙烯、ＡＢＡ、茉莉素、水杨酸等植物信号分子以及干旱、盐碱、低温、冻害、病害和机械伤害等逆境胁迫的诱导，即使是同源性很高的ＥＲＦ转录因子也会有不同的诱导表达方式，并在植物对逆境胁迫与激素应答反
应中发挥重要的调控作用。如拟南芥ＥＲＥＢＰ家族成员ＡｔＥＲＦｓ基因的表达受乙烯、病原体、干旱、高盐、冻害、机械伤害的诱导，参与对逆境胁迫的应答反应［２１］；番茄Ｐｔｉ４受茉莉酸、乙烯和伤害、低温、高盐或干旱等逆境胁迫的诱导［２２］；番茄ＥＲＦ家族新成员ＪＥＲＦｓ的表达受乙烯、ＭｅＪＡ、ＡＢＡ、水杨酸以及高盐、低温和干旱等因子的诱导［１４￣１８］。水稻ＯｓＥＢＰ－８９的表达受ＡＣＣ、高盐和２，４－Ｄ等诱导［２３］；长春花ＥＲＦ家族成员ＯＲＣＡ２和ＯＲＣＡ３受茉莉素和激发子的强烈诱导并激活ｓｔｒ基因表达，而ＯＲＣＡ１则不受茉莉素的诱导［６，２４，２５］。拟南芥ＥＲＦ１在ｅｉｎ２和ｃｏｉ１两种突变体中都不能诱导表达，而在野生型拟南芥中乙烯和茉莉酸甲酯素同时诱导ＥＲＦ１表达呈现出两种激素单独诱导量的叠加效果［２６］，表明ＥＲＦ１是乙烯和茉莉素途径的一个交叉点，可以协同调控两条信号途径中下游相关基因的表达。
李文正等：１ＥＲＦ转录因子及其在烟草抗逆性改良中的应用３１
生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００６年第４期
３ＥＲＦ因子与不同元件和蛋白互作调控下游基因的表达
高等植物基因表达特性依赖于启动子种顺式作用元件与转录因子的协同作用。ＥＲＦ转录因子的ＤＮＡ结合域的Ｎ－端是含有３个β－折叠的碱性亲水区，决定这类转录因子与不同的作用元件的结合。
ＥＲＦ转录因子可以与ＤＲＥ／ＣＲＴ（ＤＲＥ：ｄｅｈｙｄｒａ－ｔｉｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＣＲＴ：Ｃｒｅｐｅａｔ，保守序列为ＣＣＧＡＣ）、ＧＣＣｂｏｘ（保守序列为ＧＣＣＧＣＣ）和ＪＥＲＥ等元件结合。ＤＲＥ元件（核心序列ＴＡＣＣＧＡ－ＣＡＴ）最早从拟南芥干旱应答基因ｒｄ２９Ａ的启动子中鉴定。此后在拟南芥冷诱导基因ｃｏｒ１５ａ启动子区发现一个类似的序列ＴＧＧＣＣＧＡＣ，称为ＣＲＴ元件［２７，２８］。两个顺式元件有一个共同的核心序列ＣＣ－ＧＡＣ，而且相关的基因参与由干旱、盐碱及冻害所引发的渗透胁迫应答反应，因此把这两种顺式元件统称为ＤＲＥ／ＣＲＴ顺式元件。现已从拟南芥、番茄、小麦和水稻等植物中分离出和ＤＲＥ／ＣＲＴ特异互作的ＥＲＦ家族成员，如拟南芥ＤＲＥＢ１（ＤＲＥＢ１Ａ／ＣＢＦ３、ＤＲＥＢ１Ｂ／ＣＢＦ１、ＤＲＥＢ１Ｃ／ＣＢＦ２）和ＤＲＥＢ２。植物的许多抗病相关基因启动子都含有ＧＣＣ－ｂｏｘ，研究表明烟草ＥＲＦ１／２／３、番茄Ｐｔｉ４／５／６、拟南芥ＡｔＥＲＦ１／２／３／４／５和水稻ＯｓＥＢＰ－８９等ＥＲＦ因子能与ＧＣＣ－ｂｏｘ结合。近来在茉莉素和激发子应答反应的基因中发现一种含有ＧＣＣ核心序列的２４ｂｐ的ＪＥＲＥ元件，已经鉴定出三个和ＪＥＲＥ元件特异结合的ＥＲＦ家族成员ＯＲＣＡ１／２／３［６，２４，２５］。
ＥＲＦ蛋白的Ｃ－端区还包包含１个由１８个氨基酸残基组成的核心序列，该序列形成双亲性的α－螺旋参与同其它转录因子或ＤＮＡ间的相互作用，并提高基因表达调控的效率和灵活性。ＥＲＦ转录因子通过与ＡＢＡ信号途径的ｂＺＩＰ转录因子的相互作用，调控植物乙烯和ＡＢＡ信号途径的交叉
对话［２９］。水稻ＥＲＦ因子ＯｓＥＢＰ－８９与ＭＹＣ因子ＯｓＢＰ－５协同作用，促进水稻中与直链淀粉合成相关基因Ｗｘ表达［３０］。此外，许多ＥＲＦ家族成员还通过蛋白磷酸化途径来发挥功能，番茄受到含有ａｖｒ基因的病毒侵染时，ＡｖｒＰｔｏ与Ｐｔｏ互作并磷酸化Ｐｔｏ；后者进一步磷酸化Ｐｔｉ４并提高其与ＧＣＣ－ｂｏｘ的结合和相关基因的表达。Ｐｔｏ激酶还能与烟草中的ＥＲＦ２特异作用，通过磷酸化调控ＥＲＦ２的核定位特性［１１，３１］。
４烟草中ＥＲＦ的研究与转基因应用
目前已在烟草中相继克隆出ＮｔＥＲＦ１、ＮｔＥＲＦ２、ＮｔＥＲＦ３、ＮｔＥＲＦ４、ＮｔＥＲＦ５、ＥＲＥＢＰ－６、Ｔｓｉ１和ＮｔＣＥＦ１等ＥＲＦ因子基因，其中ＮｔＥＲＦ１／２／３／４的表达受乙烯利、光照和伤害等因子的诱导，在种子萌发过程中ＮｔＣＥＦ１／２没有表达；生化分析发现ＮｔＥＲＦ２和ＮｔＥＲＦ４具有明显的转录激活的功能，而ＮｔＥＲＦ３在烟草中作为转录抑制因子，这些结果表明，烟草ＥＲＦ家族成员在有着不同的生化调控作用［３２，３３］。烟草ＮｔＥＲＦ５的表达具有严格的组织特异性，即只在部分花器官的萼片中表达；而且该基因的表达受伤害和病毒侵染的诱导，但不受水杨酸、乙烯和茉莉酸的影响［３４］。烟草ＮｔＣＥＦ１的表达受乙烯、ＡＢＡ、水杨酸、低温、高盐和干旱等激素和逆境胁迫的诱导，而且该基因在拟南芥中的超表达能激活乙烯应答和防御相关基因的表达，提高拟南芥的抗病性［３５］。烟草Ｔｓｉ１受盐、水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯和伤害的诱导表达，可以结合ＧＣＣ－ｂｏｘ和ＤＲＥ／ＣＲＴ等元件，激活
植物抗病相关基因和抗渗透胁迫相关基因的表达，提高转基因烟草和辣椒的抗病性和耐盐性［３６，３７］。与拟南芥ＥＲＦ１基因表达类似，烟草ＮｓＥＲＦ２启动子中含有一个假定的ＥＩＮ３结合位点，烟草中ＥＩＮ３同源物可以调控ＮｓＥＲＦ２的表达。由于ＮｓＥＲＦ２含有一个ＧＣＣ－ｂｏｘ，这样ＮｓＥＲＦ２可能受到自身或者其他ＥＲＦｓ的调控，进一步放大病原体和乙烯信号［３８］。
由于环境恶化、耕地面积减少、土壤盐碱化、干旱以及烟草病虫害危害等严重影响烟草的生产。选育抗逆品种作为解决烟草农业生产面临诸多问题的一个最经济有效的根本途径。植物对逆境胁迫的应答是多基因参与的协同反应，单一功能基因的转基因对农作物抗性的改良有其局限性，而上游调节基因的应用成为植物抗逆性改良的新方向。近年来大量的研究表明，ＥＲＦ家族基因在植物中的同源或异源超表达能有效地改良植物的抗逆性。拟南芥、烟草、番茄及草莓中超表达ＣＢＦ１或ＣＢＦ３能提高转基植株的抗旱性和抗冻性［８］；烟草Ｔｓｉ能提高辣椒对Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ和Ｐｈｙ－
３２
２００６年第４期
ｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ的抗性［３６，３７］。烟草Ｔｓｉ１同源超表达能够诱导ＰＲ
基因的表达，提高烟草对病原物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ的抗性和对高盐的忍受能力；烟草ＮｔＥＲＦ５的同源表达能提高烟草对Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｅ的抗性［３４］。辣椒ＣａＥＲＦＬＰ１在烟草中的超表达能提高烟草对Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ的抗性和高盐的耐性。我们的研究表明，转基因植物中番茄ＪＥＲＦｓ超表达激活烟草中下游抗逆功能基因的表达，提高转基因烟草耐盐性、耐旱性、耐冷性和抗病性，可见ＥＲＦ转录因子的转基因应用是提高烟草等农作物综合抗逆能力的有效策略。
党政机关公务用车预算决算管理办法
５展望
近年来有关转录因子在植物逆境应答反应中的研究已成为植物分子生物学领域的前沿和热点。ＥＲＦ家族基因的分离与表达特性及其在植物的生长发育和胁迫应答反应等方面的研究取得了很大的进展。目前有关ＥＲＦ的功能是通过基因超表达分析的，而相应突变体及其表型还没有报道，所以运用相关的突变体或ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干扰）等技术剖析ＥＲＦ因子的功能是十分必要的；研究相关基因启动子的结构和特性将有助于阐明ＥＲＦｓ调控植物逆境应答反应的分子机理；分析ＥＲＦ蛋白的互作因子为阐明其对多种信号途径调控的生化基础提供有力的依据。
生物和非生物胁迫是农作物生长和产量的主要限制因素，植物的胁迫应答反应是由多基因协同控制的。传统育种技术是改善植物抗逆性的主要手段，其不足是依据经验配置组合，盲目性大、效率低、
周期长；而利用生物技术，并辅以传统育种技术提高植物抗逆性目标性强、效率高、周期短。转录因子在植物抗逆、抗病信号转导中的重要调控作用，因此以相关ＥＲＦ基因转化植物是提高植物综合抗性新策略。近年在烟草中的转ＥＲＦ基因研究表明，不同转录因子在烟草中的同源或异源表达能有效地提高烟草的抗逆性并呈现出诱人的前景；进一步鉴定和克隆烟草新的ＥＲＦ家族新成员并分析相关的特性和功能，为挖掘烟草的优良基因资源和烟草抗性的分子育种提供坚实的理论依据和应用基础。
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·信息交流·
加拿大限制进口印度草药
ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｓｉｎｅｓｓＮｅｗｓ２００５年８月１２日５页报道：最近加拿大药物管理局宣称，鉴于某些印度草药遭受大量重金属诸如铅和砷的污染，故已下令将这些草药清除出加拿大市场，同时限制其进口。并规定只有经过检验合格的印度草药，才能被批准入市。指出某些遭受重金属污染的印度草药，服用后可引起腹痛、呕吐、肌肉痛性痉挛、心脏病、肝损害、贫血和运动神经障碍。例如铅中毒可引起体重下降、头晕和麻痹，汞中毒可引起震颤、记忆力减退、动物神经功能丧失和精神障碍。汪开治３４
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