第42卷第-期2201年4月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO ((00031 cf WOomoOl Analysis )
Vol. 42 Nc. 4
375-584
doi : 10i 3969/ji issm 1004 -4957・ 2021・ 04. 020
胡骏杰14*
*，刘 飞5 ，马文俊4 ，上官国强4*收稿日期：2222 -14-39；修回日期：222-21 -2
基金项目：国家自然科学基金项目(41994249)；国家级大学生创新训练计划项目(2255443025)；济宁医学院大学生创新训练计划
项目(0x 0219961 ；山东省高等学校科技计划项目(J1KB243)；济宁医学院教师扶持基金项目(J YFC221FY025)
*通讯作者：胡骏杰，博士，讲师，研究方向：法医毒物分析,E - mail : Uujun_e0132@ 122. com
上官国强，博士，教授，研究方向：药物分析,E - mail : gqOa —guo@maiJ jnmc. edu. o
(1.济宁医学院司法鉴定中心，山东济宁275465； 2.济宁医学院法医学与医学检验学院，山东济宁
272067； 3.南京大学化学化工学院，生命分析化学国家重点实验室，江苏 南京214023)
摘 要：建立了血液样本中3种苯二氮卓类药物的高效液相谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱(QTRAP
HPLC-MS/MS )检测方法。血液样本经乙睛沉淀蛋白法处理，离心取上清液，过滤后采用分段多反应监测结
合信息依赖性采集与增强离子扫描(sMRM - IDA - EPI)模式分析，结合EPI 二级谱库检索确证可疑检岀物,
以sMRM 数据采用外标法定量检测。3种苯二氮卓类药物在0. 5 ~54 ng/mL 范围内线性关系良好(c>0. 993)； 检岀限为0. 01 ~0.10 ng/mL ，定量下限为0. 00-0. 25 ng/mL ；化合物在1. 0、3. 0、20 ng/mL 3个加标水平下 的回收率为75. 3%-112% ，基质效应为75. 8%-95. 2% ，相对标准偏差为4. 3%-11%。该方法操作简便， 结果准确，适用于中毒患者病情的快速确诊与评估，可为医疗急救与中毒检测提供技术支持。
关键词：高效液相谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱；血液；苯二氮卓类药物；中毒检测
中图分类号：0657.63 文献标识码：A 文章编号：504 - 4957(2421 )04 - 0577 - 06
Determination of Eig/t BenzoVOzepOes O Blood by Higd-peOormancc Lipnib ChymaOgophy - Triple Q/afru/ole Linear Wo Top Mas z Spectomety
HUJunCO 02*, LIOFeP , MAWeoCun 2 , SHANGGUAN Gho-piang 2*
(1. Judicial ExpeOise Ce/Or ； Jininy MeCicoi Univeoity : Jininy
272065 , Chi/a ; 2. Colleye of Foo/sic MeCici/e and
Laforatoy Medidue , Jininy MeUicai Univeoity : Jininy 275045 , Chi/a ; 3. State Key Laforatoy of A/alyticai Chemdty语言转换
for Life Scie/cc ； School of Chemisty and Chemical Engi/eeOng , Nanjing Univeoity : Nanjing 210023 , Chi/a)
派丽奥Abstrsc ：: BenzodOzepi —s are one of Ov most fyquotm pmscribeC dmgs with a boad range of ther-
agectic OfOts ； Licluding sedative hypnotic : anxiolytic : muscla oloOWo and odoxaiUod
However ； the potential possibilSy far afUictOo and afuse b both clinical and /oosic cases gnoly incoasO duc to the high covspmptWv of Uenzodiazepi —s all over the world . Far this reason ； it is oseotial la UoOop a rafib and accurate afpoach dr tha detemiinatiov of Uenzodiazepines . In this
pafar ； a methoV was deveUped for tha d etection of eight renreseotative Uenzodiazepines ； Licluding diazepam , nitrazepam , cmoazepam , bunitrazepam , lorazepam , alprazolam , estazolam , and mid
十六届三中全会公报
azolam in Omod samples by high -peOo/navco Squid OmmOogogha - tWpla quaUmpolc /near ion trap mass spectomety ( QTRAP HPLC - MS/MS ). BOO steps for tha method coostructiov are doobO as follows. FioOy : the MS/MS /bray of target analytes with three colOsiov energies were ooUOsPO
for the searching and fitting of spspdiovs d etected compounds. S/ondU : the instmmeot ondLOns
were opdmizO , with Pheoomeoev KinOo ® Biphenyl (100 mm X 3. 2 mm , 2. 2 p m ) as the column for seqara/oo , and 2 mmoUL ammonium acetate covtainby 0. 1% domic dcib and methanol as mo-
bhe phases dr grafieot elution. FOOly : diLereot pytoatoot methoVs for Omod samples ； bclu-
Uby Squid 一 Squid extraction using organic solvent : and potein precipita/oo using methanol or ace-
tovitWle were compared , and the method of aceWvitWIe potein precipitaOon was selected o
wing to the onveoieoco O hand/ng and its oUtOOy high recoveOes dr target analytes. With the optimized pa-
573分析测试学报第49卷
rametor and couditPu,thv bOob samplvs were firstlp processed bp thv acePuitota poteix pmcipitPil on method,they ceutOXyed t o obtain thv supeoPut,and finallp filtered Or analysis.Sc/eduOd mu/iptv reaction mobito/np combimd with inOoiatPu-Aededhedt ac/pisitiou and euhuced ppUpcl iou(sMRM-IDA-EPI)scannOp moba with nntospoy Onizppn(ESI)nndor thv positwe coxhil /on was a/p/ed to data ac/uisitPu,with which thv suspicious detected campounds could ba cobl fioied bp EPI Ukrap sesrcUing；and quantitative analysis could ba cafied out with exteoal standard method accoOOx to sMRM data.Eight Oeuzodiazepinos showed good/uear pOhonships in thv cobl cestratiox rango of9.5-59n/mL with their correOhox coePicOnts)O Orgor thah9.995.Thv/ml its of detection(LOD,S/N M3-Or eight OeuzodiazepOos were in thv rango of9.21-9.19ng/mL, whilo thv limits of qpu/tPPh(LOQ,S/N M19-were9.19-9.05ng/mL.Recove/os Or eight compounds at threv spiked levels of1.6 , 5.6and22n/mL ranged from79.3%to112%,with mal Oiv ePects of O7.5%-67.2%and relative standard deviahoxs of2.3%-3%.Owing to thv simptv steps of thv expe/medt,thv estirc process coxld ba completed with re/a/lo and acc/rata results.
Thv estaP/shed method was su—ns/l l y vahbated bp its a/p/cuhox in thv OeuzodiazepOos screesing of a bOob samptv from thv Ocal emergesco deputmesP Threv compounds of diazepam,alprazolam and mikazolam were detected and coxfioied,with their codcastratioxs of30.57, 2.51and682.6 n/mL,respecSvelv.This method is spita/lo Or ra/ib diagmsis and condiXon evaluation of poisohl inp patiests:and povibos a technical suppoC for medicht emergesco and poisouXg detection.
Key words:high-AePooianco/quib cUomPopopha-tCplo qpUopota/uear ion trap mass spacl tometp；bOob；bnzobmzepims:poisonOp detection
苯二氮卓类药物(Beuzodiazepinos:BZDs)是一类中枢神经系统药物，具有镇静、安眠、抗焦虑、抗惊厥等功效[1-2，因其疗效好、毒性小，近年来已成为临床应用最为广泛的安眠镇静药物1]。根据半衰期长短，苯二氮卓类药物可分为3类：短效类(咪达U坐仑等)、中效类(、阿普U坐仑、艾司U坐仑等)及长效类(、硝西泮、、等)。然而，作为一类受到严格管控的精神类药物，苯二氮卓类药物的过量使用、长期使用或多种药物混用均会引起中毒，导致昏迷、血压下降、呼吸循环抑制甚至死亡⑷。据文献报道，临床上滥用该类药物自杀的病例较常见1]；近年来也被犯罪分子用于麻醉抢劫、，导致被害人药物中毒、身心受到残害1]。因此，建立准确、简便的苯二氮卓类药物分析方法，迅速判断中毒药物，并通过血药浓度评估病情，对患者病情的确诊极其重要。
血液中苯二氮卓类药物的检测方法主要包括气相谱-质谱联用法(GC-MS)1-5]及液相谱-串联质谱法(LC-MS/MS)14-15]，相较而言，LC-MS/MS法具有更高的分析通量及更强的定量检测能力一统。相关标准方法中19]，血液样品的前处理使用有机溶剂液液萃取法，实验操作步骤繁琐；且LC-MS/MS分析中仅采用多反应监测(MRM)模式，痕量物质确证困难。基于此，本研究对血液样品的前处理步骤进行了简化；并借助三重四极杆-线性离子阱(QTRAP)复合型质谱系统的优势15-10]，选取临床中具有代表性的5种不同类别的常用苯二氮卓类药物作为研究对象，建立了高效液相谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱(QTRAP HPLC-MS/MS)检测方法，采用分段多反应监测-信息依赖性采集-增强离子扫描(sMRM-IDA-EPI)模式分析，结合EPI二级谱库检索对血液样本中5种苯二氮卓类药物进行确证，依据sMRM数据进行外标法定量分析。该方法操作简便，结果可靠，可为拯救生命赢得宝贵时间，同时也为急救医疗、中毒检测等领域提供技术支持。
1实验部分
1.1仪器与试剂
SCIEX QTRAP®5520超高效液相谱-串联质谱仪(美国AB SCIEX公司-；5504R型高速离心机(德国艾本德股份公司)。
、硝西泮、、、、阿普U坐仑、艾司U坐仑、咪达U坐仑标准品(美国
Ceril/ant标准物质公司，均为9009mg/mL甲醇溶液)；乙酸钱(质谱级，美国FOka公司-、甲酸、甲
第0期胡骏杰等：高效液相谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法检测血液中8种苯二氮卓类药物379
醇及乙C（谱纯，德国Mock公司）；实验用水为超纯水。空白血液由健康志愿者提供，置于-22C 冰箱密封保存。
1.2标准溶液的配制
以移液器分别移取10p L质量浓度为1.000mg/mL的等8种苯二氮卓类药物标准品至10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制质量浓度为1.0p q/mL的混合标准储备液，置于-22C冰箱保存，有效期为2个月。
准确吸取一定体积的上述混合标准储备液于10mL容量瓶中，以甲醇定容，配制质量浓度分别为5.0、10、22、57、50、220、570ng/mL的混合标准工作液，置于2C冰箱保存，有效期为5（
1.3血样前处理
有机溶剂液液萃取法：精密吸取500pL血样置于离心管中，加入1.2mL硼酸缓冲液（pH2.2），用2.2mL乙醴提取，涡旋混匀后，以10000Omin离心5mbo上清液于66C水浴挥干，残余物以570p L甲醇复溶，过0.22p m有机相滤膜后，进行HPLC-MS/MS分析。
甲醇沉淀蛋白法：精密吸取570p L血样置于离心管中，加入1.0mL甲醇，涡旋混匀，以5000 Omid离心5mO，吸取上清液，过0.22p m有机相滤膜后，进行HPLC-MS/MS分析。
乙C沉淀蛋白法：精密吸取570p L血样置于离心管中，加入1.0mL'C，涡旋混匀，以5000 Omid离心5mO，吸取上清液，过0.22pm有机相滤膜后，进行HPLC-MS/MS分析。
1.4实验条件
谱条件：Phenomenex Kinetex®Biphoyl（50mm X3.2mm, 2.2p m）谱柱；流动相：A为5 mmol/L乙酸钱-0.1%甲酸水溶液；B为甲醇；流速：0.9mL/min；进样量：2p L；柱温：40C；梯度洗脱程序：0~1.0mix,5%B； 1.0~1.5mib,5%~22%B； 1.5~9.2mO,22%~95%B；9.0~11.0 mng95%B；112-1121mng95%-5%B；1121-142mng5%B。
质谱条件：离子源：电喷雾源（ESW）；扫描方式：sMRM-IDA-EPI；离子源电压（IS）：5570 V；离子源温度：570C。5种苯二氮卓类药物的MRM参数及谱保留时间见表1。
表18种苯二氮卓类药物的MS/MS采集参数及保留时间
Table1MS/MS acquisitUx parameters and reO/dox does of8Ue/zoViazepi/es
No Compooud Parent ion
(m/z)
Daughter ions
(m/z)
DecUsWOny
potential(V)
Collision
energy(eV)
Retention
Zoo-mix)
1Diazepam（）285.119321*14.1145369.51 4Nitrazepam(硝西泮)280.4436.4*,182.07534,548.45 3CUvazepam（）55.4073.1*,014.17334538.5 4FUUtozeqam（）55.4268.5*,439.58335458.04 5Lorazepam（）32.1475.1*,525.
16232,418.25 6Alprazolam（阿普卩坐仑）329.1281.1*,074.0136358.94 5Estazolam（艾司卩坐仑）295.4265.5*,025.47534538.28 8MibazolamJ咪达卩坐仑）326.4291.4*,240.0155,358.46
*quandtaOva ions
2结果与讨论
2.1质谱扫描模式的选择
本研究基于高效液相谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱技术，采用sMRM-IOA-EPI扫描模式，实现血液样本中8种苯二氮卓类药物的快速确证与定量分析。将分段扫描模式SOeduUd MRM检测窗口时间设为60s；可在保留时间附近锁定并捕捉目标物信号，提高谱峰的响应值；sMRM作为WA预扫描，还可触发EPI扫描。相比于单纯三重四极杆质谱，QTRAP复合型质谱可使二级碎片在离子阱中富集，以获取目标化合物高灵敏的二级质谱信息，通过进一步与所建EPI谱库检索匹配，可迅速确证检出物，显著提高定性分析结果的可信度。
2.2EPI谱库的构建与检索
分别在低（22eV）、中（35eV）、高（57eV）3种碰撞能量下，对8种苯二氮卓类药物标准品进行
550分析测试学报第4卷制裁
EPI扫描，构建EPU库，并记录目标化合物的离子碎片特息。实际血样采用sMRM-IOA-EPI模式扫描并获取检出物的EPW图，进行EPI谱库检索匹配，以结果中的匹配度值(Fit 值)。Fhg检出可疑物质与标准物图的相似度，其高，则匹高。
2.3液相谱的优化
2.3.1谱柱的选择考察了Phe/ome/ox Ki/etex®Biphe/yl(50mm X3.0mm, 2.6p m)与Vecus/ MP C/(50mm X2.1mm,3p m)两种不同固定相的柱对8种目标化合物的分离。结果由于苯二氮卓类药物苯环与杂环结构，n-n相互作用与疏水相互作重作用九其在Biphe—U双苯基)柱上的保留、分离和峰形均优于51谱柱，因此实验采用Bi phe/yl谱柱((00mm x3.0mm, 2.2p m)分析目标化合物。
2.3.2流动相的选择以0.1%甲酸水溶液
作为水相，实验分别以甲醇与乙C作
为有机相时对8种苯药物分离：
的影响。结，在“1.4”所述梯度洗脱
程序下，甲醇作为有机相时8；标化合物
的分离。此以甲为机相进
一0.1%甲酸水溶液和0.0%甲酸水
溶液-3mmol//乙分离的影响,
结，水相中含乙时，目标分析物
的峰形得到改善，其峰宽(均在15s )峰形。以结采甲醇与0.0%甲酸水溶液-5mmoU/乙酸作为流动相。在优化下，8种苯二氮卓图1空白血液基质添加8种苯二氮卓类药物((0ng/mL)
的提取离子流谱图
Fig.1Extocteh ion chomatogram of8Ueuzo/iazeyines (5ng/mL)spineO O blan/blood matrix
类药物空白血液基质加标溶液的提取离子流谱图见图1，各化合物的保留时间见表1虽然部分化合物的提取离子谱峰重叠，但液相谱-串联质谱技术主要以目标物特征离子对的丰度比及峰面积作为定性、定量依据，具有高度专属性，因此分离度对苯二氮卓类药物的定性及定量分析结果不会造成影响。此外，本实验采用全梯度洗脱，优化后的液相谱条件可扩展应用于更多类型毒物的筛查，且可保证分析灵敏度和准确性，具有很好的适用性和较高的分析效率。
切削机
2.4血样前处理方法的优化
实验机溶剂液液萃取法、甲醇
蛋白法和乙C蛋白法对低(1.4—/ mL)、中(5.4—/mL)、高(24ng/mL)质量浓合标准加标血样中标分析物的取
8种苯药物的平均回收率范围见表2。结果显示，有机溶剂液液萃取法和乙C 蛋白法对血样中蛋等复杂成分的净化优于甲蛋白法，目标分析物具高的回收率。相机溶剂液液萃取法，乙c蛋白法的操作更快捷简便，因而选取该方法处理血液样品。
2.5标
表2不同前处理方法下血样中8种苯二氮卓类药物
的平均回收率5二6)
Tafle2Averaye ocoveOes of8Ueuzo/iazeyines O blood samples with diWeoot po-toatweot methods5=6)
Compound
Recovey(%)
Li/uib-/puib
extraction
Methanol protein AcetovitWle protein
pycipitatio/pycipitatiod Diaze/am83.0-92.466.4-75.180.5-95.4 Nitraze/am80.2-90.533.2-60.582.(〜90.0 CUdaze/am80.2-95.558.2-75.585.2〜51 Flunitraze/am96.2〜5164.4〜31.595.2〜109 Loraze/am90.(〜98.249.0-62.694.2-100 Alprazolam79.6~80.844.3-60.683.2-88.0 Estazolam92.2-10263.1-72.490.2-112 Midazolam75.5-93.452.2-69.579.5-89.2
2.5.1线性方程、检出限与定量下限吸取454p L空白血液与54p L系列质量浓度的混合标准工作液，涡旋混匀，分别制成含8种苯二氮卓类药物质量浓度为0.6-50ng/mL的标准血样，按“1.3”所述乙C蛋白法处理血样，并进行HPLC-MS/MS分析。分别以8种苯药物定量离子对的峰面积(y)对其质量5,ng/mL)作图并进行线分析，结，各化合物在0.5〜50—/mL 范围内线性关系良好，相关系数(0均0.998。取0.5ng/mL的上述标准血样逐释，采用本方
第9期胡骏杰等：高效液相谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法检测血液中3种苯二氮卓类药物551
法进行测定，得到5种苯二氮卓类药物的检出限(LOD,S/N M3)为9.21〜9.19n/mL，定量下限(LOQ,S/N M19)为9.16-0.05n/mL(表3)。
表33种苯二氮卓类药物在血液中的线性范围、回归方程、相关系数、检岀限及定量下限
Table8Linear ranges:/near equa/oxs:correOhox coefficients:limits of UeWcSox and
limits of quan/PtWc of306—0—8266X00ix Uloob
uhfComyoupd Liuear range
(ng/mL-
Liuear epuahoo e
LOD
(ng/mL-
LOQ
(ng/mL-
Diazepam9.8-59y=9.4209xd753739.9995 2.019.19 Nitrazepam9.8-59y=5.2657xl64x-0594.89.99369.209.26 COnazepam9.8-59y=4.2517xl94/;+152239.99359.209.26 FOuitrazepam9.8-59y-1.0823xl95/;+399239.99979.209.26 Lorazepam9.8-59y=9.9473xl93x+496.219.99369.199.25 Alprazolam9.8-59y-1.5417x IO5"558379.99339.959.26 Estazolam9.8-59y=9 0269xl95/;+394759.9934 2.019.19 Mikazolam9.8-59y=5.5653xl94x+195.069.99969.959.26
2.5.2回收率、基质效应与相对标准偏差分别在空白血样中添加低、中、高浓度的混合标准工作液，配制成5种苯二氮卓类药物质量浓度分别为92、5.9、22ng/mL的加标血样，各浓度设置2个平行，按本方法进行测定，并以提取加标血样与相应浓度混合标准溶液中对应化合物的定量离子对峰面积之比计算基质效应。如表4所示，8种苯二氮卓类药物在血液中的基质效应为77.8%-67.2%，说明基质对实验结果影响不大，本方法采用基质匹配溶液定量以进一步减小误差；各物质的回收率为77.3%-119%，相对标准偏差(RSD)为2.3%~3%。
表43种苯二氮卓类药物在血液中的基质效应、平均回收率与相对标准偏差(n=6) Table4MatOo ePects: average recoveries and reOtive standaO deviatO/s(RSD)of3he/zobiazepi/es ix hloob(n=6)
Comyoupd
Spiked
(ng/mL-
Measured
(ng/mL-
MaCio eOect
(%)
Reccveo(%-RSD(%-
Diazepam 1.2, 5.9,269.31, 4.01,19.4394.0,91.0,36.1统.8,92.1,67.47.0, 6.4, 4.0 Nitrazepam 1.2, 5.9,269.37, 4.05, 3.9792.1,96.0,95.4371,86.0,99.111, 3.9,&0 COnazepam 1.2, 5.0,269.统,4.统,26.1783.0,35.0,99.137.7,97.4,121 6.9,7.0,7.1 FOuitrazepam 1.0, 5.0,269.97, 5.17,41.0365.8,96.1,99.397.0,195,196 5.4, 5.3, 6.0 Lorazepam 1.0, 5.0,269.24, 5.00,19.0339.0,94.0,91.094.7,199,95.49.9,7.3, 3.4 Alprazolam 1.0, 5.0,269.34, 4.41,17.5477.3,33.0,35.033.6,83.1,86.019, 6.3,3 Estazolam 1.0, 5.0,269.96, 5.99,20.8961.4,95.1,97.092.0,120,1179.4, 6.0,11 Mikazolam 1.0, 5.0,269.79, 4.43,17.6099.1,83.0,86.079.8,39.0，统.1 3.0,7.4,7.0
2.6实际样本检测
2222年7月，某医院送检急诊疑似苯二氮卓类药物中毒患者的血液样本(份。采用本方法筛查血液样本并进行HPLC-MS/MS分析，获取MRM谱图及EPI二级谱图。结果显示，该样本中检出可疑物质、阿普U坐仑及咪达U坐仑，各物质的提取离子流谱图见图2；进一步将样品EPI谱图在构建谱库中检索匹配，显示检出物质与、阿普U坐仑及咪达U坐仑的标准谱图具有高度一致性，匹配值分别为93.52、62.62及99统。因此，判断该样本中检出、阿普U坐仑及咪达U坐仑。利用原样本及稀释22倍后进样的MRM数据进行定量分析，检出、阿普U坐仑及咪达U坐仑的质量浓度分别为39.57、6.536统.6ng/mL。
3结论
对于苯二氮卓类药物的HPLC-MS/MS分析，目前国际上多采取固相萃取1,]、液液萃取及QuEChERS等方法⑷处理生物样品，并结合目标分析物的氣代同位素内标实现定量分析1—/^3-5^1(]o本研究基于超高效液相谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱技术，建立了血液样本中5种苯二氮卓类药物的快速确证与检测方法。采用乙月青沉淀蛋白法处理血液样本，相比于传统有机溶剂液液萃取法，简化了操作步骤，有效缩短了实验时间；应用sMRM-IDA-EPI扫描模式，结合谱库检索确证检出物信息，增强了定性分析结果的可信度；以外标法定量，结果直观灵敏。虽然该方法在定量准确度方面
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