广东医学2020 年丨丨月第 41 卷第 22 期Guangdong Medical Journal Nov. 2020, V〇l. 41，No. 22•2287 •
生成的作用机制
孙玉莹、肖欧2，黄春雨
中山大学肿瘤防治中心’防癌体检中心、3内镜科（广东广州510060); 2中山大学中山眼科中心眼底内科（广东
广州510060)
【摘要】目的通过建立氧诱导视网膜血管病变（OIR)模型，探讨Toll样受体4(TLR4)在视网膜新生
血管中的作用及其机制：方法使用7日龄新生TLR4基因敲除（TI.,R4…）C57BL/6J小鼠和7日龄新生
C57BL/6J小鼠建立01R模型。分别于小鼠第12天（P12)、17天（P17)和21天（P21)时通过小鼠视网膜荧光
灌注铺片观察新生血管面积，评估新生血管情况：通过免疫荧光染，观察TLR4在小鼠视网膜中的表达情 况_.通过Real - Time PCR检测两组0IR小鼠P12和P丨7视网膜组织中核因子-k B(N F- k B)、血管内皮细
胞生长因子（VEGF)和促炎因子白细胞介素-6(I L-6)的mRNA表达水平结果在0IR模型中，通过视网
膜荧光灌注铺片发现P12两组小鼠视网膜出现无血管区，P17均出现无血管区和新生血管簇，而且新生血管
面积达到最高峰。P12、P17和P21时，TLR4——0]R小鼠中的视网膜新生血管面积均明显比正常0IK小鼠减
少，差异有统计学意义（f<0. 05).，通过免疫荧光检测发现TLR4在小鼠视网膜上广泛表达，与未建立0IR模
型的正常小鼠相比，在P17时正常0IR小鼠视网膜的TLR4表达明显升高对比正常0IR小鼠，TLR4 一OIR
小鼠视网膜组织的N F-k B、VEGF和促炎因子I L-6的表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05)._.
结论TLR4在视网膜新生血管形成过程中起到重要作用，TLR4基因缺失通过抑制NF - k B信号通路，减少
血管生成因子和炎性因子的释放，抑制0丨R小鼠视网膜新生血管的生成..，
【关键词】T oll样受体4；视网膜新生血管；（)m动物模型；T L R4基因敲除小鼠；炎性因子
【中图分类号】R774. 1;R364.3 【文献标志码】A
DOI ： 10. 13820/j. cnki. gdyx. 20202040
Mechanism of inhibitory effect of TLR4 on oxygen -induced retinal neovascularization in mice. SUN Yu -
ying, XIAO Ou, HUANG Chun - yu. Cancer Prevention Center，Sun Yat - Sen University Cancer Center，Guangzhou 510060, Guangdong y China
Corresponding author：HUANG Chun -y u^E-m a i l：hiuingchy@ sysucc. org. cn.
rose病毒
【Abstract】Objective To investigate the role and mechanism of TLR4 in retinal neovascularization by establishing
a model of oxygen - induced retinal angiopathy (O IR). Methods The OIR model was established by using 7 - day - old
FI.K4 gene knockout C57BL/6J mice as the experimental gioup and 7 — day -old C57B iy6J mice as the control group.
The area of neovascularization was observed by retinal fluorescence perfusion on the 121'1day (P12) , 171,1day ( P17) and
21、丨day ( P21 ). The expression of TLR4 in mouse retina was observed by immunofluorescence staining. The mRNA expression levels of NF —k B, V EG F' and pro — inflammatoiT factor IL —6 in PI2 and P I7 retinas of the two groups were de
tected by real - time PCR. Results In the OIR m odel, through the method of fluorescence perfusion retinal preparation,
we found that the retina of P I2 mice showed non - vascular area, on V\1showed non - vascular area
and neovasculariza
tion cluster, and the neovascularization area reached the peak. On P I2 and P21 , the area of retinal neovascularization in
TLR4 OIH mice was significantly lower than that in normal OIR mice. Through immunofluorescence detection, it was
found that TLR4 was widely expressed in the retina of mice. Compared with the normal mice without OIR, the expression
of TLR4 in the retina of nomial OIR mice was significantly increased on P17. Compared with normal OIR m ice, the expression levels of NF -k B, VEGF and pro - inflammatoiy factor IL -6in retina of TLR4 knockout OIR mice were signifi
cantly reduced. Conclusion TLR4 plays an important role in retinal neovascularization. TLR4 inhibits the formation
of retinal neovascularization in OIH mice hv inhibiting N F"-k B signal pathway and reducing the release of angiogenic fac-△通信作者：黄春雨，E -mail:*******************
• 2288 •广东医学2〇2〇年丨 1月第4丨卷第 22 期Guangdong Medical Journal Nov. 2020, Vol. 41 , No. 22 tors and inllammaton factors. This will provide a new strategy for the prevention and treatment of retinal neovascular disea
ses.
【Key words】toll — like receptor 4; retinal neovascularization;01R animal m odel; TLR4 gene knockout mic.e; in-
nammatorv factors
视网膜新生血管形成是多种视网膜血管病变如 视网膜静脉阻塞、增殖型糖尿病性视网膜病变、早产 儿视网膜病变等共有的病理改变，是导致视力损害 的主要原因之一、1：■新生血管形成涉及到多种机 制，其中免疫炎症反应是当前备受关注的研究领域。Toll样受体（toll- like receptors，TLR)是.—■类参与免疫炎症反应的模式识别受体，它也参与血管增 生反应，有研究报道TI.R2和TLR4可能通过上调 VEGF的表达介导血管增生反应[2_3]。TLR介导的 炎症反应在视网膜新生血管的生成过程中起到一定 作用[4]。TLR4可以通过MyD88激活核因子-k B (NF-k B)通路，促进炎症反应，同时N F-k B也参 与调控血管内皮细胞生长因子（VEGF)的表达。因此有必要研究TLR4通过NF- k B信号通路参与视 网膜新生血管生成的作用机制，2018年1月至2019 年6月，本研究通过视网膜荧光灌注铺片方法观察 TLR4
基因敲除小鼠和正常小鼠在氧诱导视网膜病变 (〇m)模型中的视网膜血管形态学变化，免疫荧光 检测TLR4在视网膜中的表达情况，PCR检测NF- K B、VEGF及其相关炎性因子的表达情况，探讨TLR4在视网膜新生血管生成过程中的信号通路及 作用机制。
I材料与方法
1.1 实验动物购买新生SPF级C57BIV6J小鼠 1〇〇只和新生SPF级TLR4基因敲除C57BIV6J小 鼠80只，饲养在温度为（25 ± 1的环境中，每天 光照与黑暗时间各12 h，由专人负责饲养及管理。本研究经实验动物伦理委员会批准。
丨.2 0I R模型的建立将80只新生T L R4基因敲 除C57B L/6j小鼠，90只新生健康的野生型C57B L/ 6J小鼠，氧诱导视网膜血管病变模型。0I R模型的 制备参照Smith等[5报道的方法，将出生后7 d(P7)的C57B iy6j幼鼠和T L R4基因敲除幼鼠与母鼠同时 置于浓度为(75 ±2)%的高氧氧箱中词养5 d，然后放 回到正常的氧环境（氧浓度一般为21%)中饲养。这 时从高氧环境中转到正常氧环境中，造成乳鼠的视网 膜处于相对缺氧的状态中。
1.3 0川小鼠高分子右旋糖苷（FITC - Dexti'an)视网膜荧光灌注铺片选取两组小鼠于第12天(P12)、17天（P17)和21天（P21)每个时间点各10 只，用4. 3%的水合氯醛0. 3 m L/100 g腹腔注射麻
醉小鼠，将麻醉好的小鼠四肢固定在操作台上。用 眼科剪剪开小鼠胸腹壁，完整暴露出心脏，在肝上缘 用止血钳夹住腹主动脉，然后用角膜剪剪开右心耳，使回流的静脉血液流走，同时用1niL的注射器和 25G针头经左心室将1m L稀释过的荧光素标记的 高分子右旋糖苷（FITC - Dxtran，用PBS稀释浓度为 50 m g/m L)缓慢注入。灌注完毕后等待2 ~3m in,
尽量使FITC - Dxtmn荧光素能够完全循环，如果观 察到小鼠心脏变大和舌尖及上肢变黄，说明心脏灌 注成功。灌注成功后用无齿镊迅速取出小鼠眼球放
人4%多聚甲醛中，室温下固定45 m in，然后将固定 好的小鼠眼球转移至PBS中，在解剖显微镜下分离 去除视网膜外面的巩膜、角膜、虹膜和晶状体，完整 地剥出视网膜，将其放在载玻片上，用穿刺刀分别从 视网膜的锯齿缘到赤道部做4个放射状切开，使其 均匀地分成4个象限，使内侧向上平铺在载玻片上，然后用抗荧光淬灭封片剂进行封片，在荧光显微镜下 观察平铺的视网膜并照相保存。观察新生血管形态
和分布，用Image - Pro P l u s软件分析测量视网膜新 生血管的面积。
医学新知
1.4 小鼠视网膜组织冰冻切片进行免疫荧光染
选取正常0IR小鼠P12、P17时取材，每个时间点
各取10只，将未经过01R造模处理的正常小鼠P12、P17每个时间点各10只作为对照。麻醉过量 处死小鼠后，用镊子迅速取出小鼠眼球放入〇CT包 埋剂中包埋，-20冷冻固定，用冰冻切片机调整切 片厚度为5 ~ 8 ，从接近视神经的部位切片，平行于眼球角膜至视乳头的矢状位方向进行均匀连续切 片，每个标本至少1〇张片。将干燥后的切片用丙酮 在室温下固定1〇 min，1xPB S漂洗3次，5 min/次。用免疫组化笔将组织圈起来，用〇. 1%的渗透剂 (Triton X - 100, PBS 稀释）50 |j l L 透化 30 min(室 温）。1%BSA(牛血清白蛋白）50 pL(PBS稀释）室温下封闭1h；用1%BSA稀释的一抗50 |xL，置于 湿盒（防止液体蒸发）41过夜。滴加Alexa Fluor 488标记的小鼠-TLR4单克隆抗体，室温下避光孵 育 1h。1x PBST漂洗 3 次，5 min/次；0_ 1(JLg/mL DAPI50 pL 染核，室温下孵育 4 ~5 min;l xPBST
间苯二酚漂洗3次，5 min /次；抗荧光泮灭封片剂封片。激光 共聚焦显微镜下以合适波长观察并拍照保存。1.5 实时定量PCR ( Real - Time PCR )检测视网膜 组织中的NF - k B 、VEGF 和促炎因子、白细胞介 素-6(11.-6)的mRNA 的表达水平分别在两组 01R 小鼠P 12、P 17时取材，每组每个时间点各取10 只，麻醉过量处死小鼠后，用RNA 提取试剂盒提取 视网膜组织的RNA ，严格按照Takara 公司的试剂盒 说明书进行逆转录合成cDNA ，进行PCR 扩增，加好 样的PCR 板经过短暂离心后，放入荧光定量PCR 扩增仪上按照以上的反应条件扩增，并进行融解 曲线分析。用软件ABI -7000打开保存结果，并 用比较CT 值的方法计算目的基因相对表达的变化 差异。
1.6统计学方法采用SPSS 20.0统计软件，两组 0IR 小鼠视网膜新生血管区面积差异比较采用独立 样
本《检验。以P <〇. 05为差异有统计学意义。2
结果
2.1缺氧诱导的视网膜血管形态和分布的改变 视网膜FITC 荧光灌注铺片结果显示正常O IR 小鼠
和TLR - _ 0IR 小鼠的P 12日龄幼鼠均在视网膜中 央部分出现大片的无灌注区，视网膜血管从视盘中 央发出的血管比较细，分支非常少，新生血管簇尚未
形成，从P 12开始新生血管出现并逐渐增多，在P 17 时达到高峰，之后开始缓慢消退。两组OIR P 17日 龄的幼鼠在视网膜中周部出现大片无灌注区，视网 膜血管出现明显的扩张、迂曲，形成团簇状的新生血 管，视网膜中周部及靠近无灌注区附近的血管密度明 显增高，血管分布紊乱。从图1中我们可以看出，P 12 时，TLR 4- 0IR 小鼠比正常0IR 小鼠视网膜血管无 灌注区范围小;P 12、P 17、P 21时TLR 4-Z - OIR 小鼠 比正常O IR 小鼠的新生血管簇明显减少。通过软 件统计分析视网膜新生血管面积发现P 12、P 17、P 21 时TLR 4 _ _ OIR 组较正常OIR 小鼠视网膜新生血管 面积明显减少[在P 12、P 17和P 21这3个时间点，与
WT -0IR 小鼠相比，P 12(0. 123 ±0.039 w 0.053 ±0. 025，n = 10)、P 17 (2. 120 ± 0.013 1.405 士0. 095，n = 10)和 P 21 ( 0. 776 ± 0. 048 0• 027 2 ±
0.047，n = 10)]，差异有统计学意义（Z 3 <0.05)见
图2。
P I 2
P17
P2I
WT-OIR
TLR4-/-OIR
注：在正常OIR(W T-OIK)小鼠和TLR4— - OIR(TLR4-O IR >小鼠中，P 12和P17时，TLR4-___ OIR 比正常0IR 小鼠的视网膜无灌注范围 小：小鼠视网膜新生血管簇在氧诱导后P17达到最高水平,P 12、P 丨7和P 21日九与正常OIR 小鼠相比.TLR4- - 0IR 小鼠的新生血管簇均较正 常小鼠明显减少.（W T 表示健康野生型C 57BL /6j 小鼠）
图1
TLR 4_ _小鼠和正常小鼠建立氧诱导视网膜新生血管病变模型（OIR)后的荧光灌注视网膜平铺片图（x
山水比德
40)
2. 2 TLR 4在O IR 小鼠视网膜组织中的表达情况 P 17时，通过免疫荧光方法检测TLR 4在正常OIR 小鼠和正常非OIR 小鼠视网膜组织的表达情况，发
现与未受任何高氧干预的正常C 57BL /6J 幼鼠相 比，TLR 4在0IR 幼鼠的视网膜组织中表达出现显 著增高（图3)。大量的TLR 4阳性细胞分布在视网 膜的多个组织层中，包括神经细胞层（GCL )-内核 层（INL )、感光细胞层和视网膜素上皮细胞层 (R P E )*a
2.3 缺氧损伤视网膜中，TLR 4—"抑制N F -K I 3信 号通路活性下调促血管生成因子和促炎症因子的表 达通过实时荧光定量PCR 检测，发现在P 12和
P 17时，TLR 4- - 0IR 小鼠视网膜组织中NF - k B 、 VEGF 和IL -6的mRNA 表达水平比正常O I R 小鼠 明显降低。在P I 7时的表达差异比较明显，VEGF 的表达降低了 2倍,NF - K B 及IL - 6均出现明显降 低[每个样品的平均值以GAPDH 的量为参考s 倍
数变化：VEGF - P12:3. 008 ± 0. 038
0. 752 ± 0. 032;
VEGF — P17:4. 162 ± 0. 084 2. 037 ± 0. 029，n =10。N F -k B -P 12:1.054 ±0.076 w 0.756 ±0.051; NF - k B -P 17:1. 232 ±0. 031 0. 715 ±0. 045，n =
10c IL 6-P 12:1.264 ±0.019z« 0.905 ±0.015;IL 6-
P17:2. 647 ±0. 023
1.695 ±0. 025,n. = 10]，差异
有统计学意义（Z 5 <〇.〇5)，见图4。| 2.5]
婆
1.0-0.5-100-
P12
P17
□ WT ■ TLR4
P21
新生血管面积
注：*与正常OIR(WT)小鼠比较/^<0.05
图2 TLR4 0IR 和正常0IR 小鼠的视网膜荧光灌注铺片图中的
新生血管面积
注：P 17时，免疫荧光染检测结果显示TLR4在正常0丨R 小鼠（W T -0IR )及正常非OIR 小鼠（W T -非0IR )视网膜组织中的表达。小鼠 缺血视网膜有明显的TLR4表达，而非01R 小鼠视网膜TLR4表达水平较低。氧诱导损伤视网膜后，视网膜各层（包括神经节细胞层（GCL) - 内核层（INL)、感光细胞层和视网膜素上皮（RPE)均可见大量TLR4阳性细胞。绿表示TLR4染；蓝表示细胞核染
图3 TLR4在小鼠视网膜表达的免疫荧光染图
3讨论 重点。许多研究发现免疫炎症反应与新生血管形成
删麵生讀引起的失配成細湘前亟雜龍縣，包搬病、輔、大®、〖、_
和肾脏
待解决的隨，新生血管的生舰制是公认晒％
Tq11
□ WT BTLR4杨义勇事件
2 14-S 1.2- < 1.0- i o s
£ 0.6
? 04
il 0.2
7： n 八
□ WT
n
小鼠比较P < 0.05
6在OIR 小鼠视网膜中的表达情况
在视网膜新生血管形成机制的科学研究中，而且此 模型具有制备简单、周期短、动物来源方便、费用低 等优点，所以本文选用TLR 4基因敲除小鼠和野生 型正常小鼠建立O IR 模型进行研究TLR 4在视网 膜新生血管中的作用机制6
通过视网膜血管荧光灌注铺片，我们发现在 0TR 小鼠中，P 12视网膜出现大量无灌注区，P 17视 网膜新生血管达到高峰，P 21视网膜新生血管逐渐 消退，无灌注区明显缩小，慢慢恢复正常。TLR 4 _ 〇m 小鼠的视网膜新生血管面积比正常0IR 小鼠明 显减少。通过免疫荧光检测发现TLR 4广泛表达在 视网膜上，对比未进行OIR 造模的正常小鼠，正常
OIR 小鼠屮TLR 4的表达明显升高，这表明TLR 4在 缺氧诱导的视网膜新生血管中起到重要作用。通过
PCR 检测发现在TLR 4 _、0I R 模型中NF - k B 、 VEGF 和IL -6的表达水平明显降低。研究结果证 明TLR 4基因敲除后，NF - K B 的活化作用减弱,
VEGF 和炎症因子分泌减少，这与1^等[19]的研究 结果一致。
我们的研究结果表明TLR 4基因缺失对0IR 小 鼠视网膜新生血管形成有明显的抑制作用。
TLR 4 +是通过抑制NF - K B 信号通路活化，减少 促血管生成因子和炎性因子的分泌，参与缺氧诱导 的免疫炎症相关新生血管形成的调控。这个结果表 明视网膜新生血管形成在某种程度上依赖与免疫炎 症反应相关的TLR 4基因的表达。因此，我们的研 究为与血管增生相关的疾病提供新的靶点，即 阻断TLM —NF -k B —VEGF 信号通路。这将为视 网膜新生血管性疾病的防治方面提供新的策略。以 此为基础，未来我们会进一步探讨TLR 4及其上游 调控因子在视网膜新生血管相关疾病中的临床应用 前景。
参考文献
[1 ]
Narayanan SP, Rojas M, Suwanpradid J, et al. Arginase in reti- nopathy[J]. Prog Retin Eye Res, 2013, 36(9) ： 260 -280.[2]
Hu L, Zang MD, Wang HX, et al. Biglycan stimulates VEGF ex-
P12 P17
P12
注：*与正常o ik (w t ) 图 4
PCR 检测 VEGF、NF - k B 、和 IL -有重要的作用，它主要参与免疫炎症反应，与肿瘤细 胞的血管供应有密切的联系，在动脉粥样硬化中也 起到重要作用。TLRs 能够通过M yD88激活NF -
k B 通路，促进炎症因子的释放。有报道指出TLR 4
在血管结构改变中也起到一定的作用，主要是视网 膜新生血管与炎症反应密切相关[84]。研究还发现
Toll 样受体可以上调VEGF 的表达，而VEGF 是促 进血管生成的经典因子。其中Toll 样受体2、4、7、9 能够调控VEGF 的表达，主要是通过与腺苷A 2A 受 体协同作用诱导NF - K B 的表达，促进VEGF 的表 达上调[l °_n ]。TLRS 通过调节VEGF 参与调控新生 血管的形成。研究发现TLR 4作为促进炎症反应的 重要因子，参与和血管损伤相关的炎症反应过 程[12]。有研究结果表明HMGB 1通过活化TLR 4信 号通路，增强VEGF 及相关炎症因子的表达，参与新 生血管生成[13]。
在眼组织中，TLRS 主要表达于角膜、结膜、虹 膜、葡萄膜和视网膜等组织[14]。TLR 4与眼科疾病 关系最为密切，L in 等[15]发现HMGB1 -T L R 4通路 参与碱烧伤诱导的角膜新生血管的形成，TL R 4在视 网膜缺血再灌注损伤中起到重要作用n6]。在小鼠 角膜化学烧伤模型中，发现TLR 4表达缺失并不能 完全抑制血管生成，但与正常小鼠相比确实有减少 新生血管的作用[17]。在人的角膜成纤维细胞
培养 中发现氢化可的松能够通过抑制T L R 2和T L R 4的 活性，降低V E G F 的表达n8]。已经发现在很多损伤 组织的血管增生反应过程中，T L R 4通过M yD88活 化N
F -k B
进而调控V E G F 的表达[|9]。诸多研究
都表明T L R 4能上调V E G F 的表达，参与血管生成 过程。因此本文主要研究在视网膜组织中T L R 4通 过活化NF - K B 进而调控V EG F 表达参与新生血管 形成的作用机制。
andida
0IR 小鼠模型能很好地模拟早产儿视网膜病变 的发病过程，与多种视网膜新生血管相关疾病的发 病机制存在相似之处，如糖尿病视网膜病变、视网膜 静脉阻塞和老年性黄斑变性等疾病，因此广泛应用
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