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(收稿日期：2020-09-08 )
•论著•
孟宪栋李娟
【摘要】目的探讨P0大鼠和成年大鼠海马素I型受体（cannahinoid type 1receptor, CB1R )
表达特点。方法取P0和3个月龄大鼠各3只，灌注固定，取海马切片，行C B1R免疫组化检测，在显微
镜下现察海马CB1R表达特征，行C B1R和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidir protein, GFAP )免疫双
标荧光检测，在激光共聚焦显微镜下观察，明确CB1R表达细胞种类。结果C B1R免疫组化D A B显， 在P0期大鼠海马，CB1R呈片状分布，主要分布在锥体细胞层神经元胞体，而在3个月龄大鼠海马，CB1R 呈点状分布，主要分布在锥体细胞层；C B1R和GFAP免疫双标显示，在P0期大鼠海马，C B1R主要分布
吴郡四姓
在锥体细胞层神经元胞体，在C A1区各层呈现点状分布，星形胶质细胞无CB1R表达，在3个月龄大鼠海马，
CB1R呈点状主要分布在锥体细胞层，星形胶质细胞无CB1R表达。结论刚出生S D大鼠和成年S D大鼠
海马CB1R表达存在差异，从出生至成年，大鼠海马CB1R可能存在从神经元胞体向神经突触的迁移。
基金项目：甘肃省自然科学基金项目（145RJZA039)
作者单位：730050兰州，中国人民解放军联勤保障部队第940医院综合内科（孟宪栋）；西安交通大学医学院附属广仁医院神经内科（李娟）
【关键词】大鼠；海马；素I型受体；星形胶质细胞；发育
中图分类号：R741 文献标识码： A 文献编号：1006-351X ( 2021 ) 05-0308-05
Differential expression of hippocampal CB1R between P0 and 3 month old rats
Meng Xiandong, Li Juan
Department of Comprehensive Medical, the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force o f Chinese People's Liberation Army, Lanzhou 730050, China
Corresponding author: Meng Xiandong, Email:****************
[Abstract] Objective To explore the expression characteristics of cannahinoid type 1receptor ( CB1R ) in hippocampus of P0 rats and adult rats. Methods Three P0 and 3 month old rats were perfused and fixed, and hippocampal slices were taken for CB1R immunohistochemical detection. The expression characteristics of hippocampal CB1R were observed under a microscope. CB1R and glia
l fibrillary acidic protein (GFAP) immunological double-labeled fluorescence detection was performed. Under a laser confocal microscope, the types of cells expressing CB1R were observed. Results CB1R immunohistochemistry shows that CB1R is mainly distributed in the neuron cell body of the pyramidal cell layer presenting patches in the P0 rat hippocampus, while in the 3—month—old rat hippocampus, CB1R is mainly distributed in the pyramidal cell layer in dots. D<»uhle immunolaheling of CB1R and GFAP showed that in the hippocampus of P0 rats, CB1R was mainly distributed in the neuron cell body of the pyramidal cell layer, and dotted in each layer of the CA1 area, while astrocytes had no CB1R expression. In the hippocampus of aged rats, CB1R was mainly distributed in the pyramidal cell layer in a punctate manner, and there was no CB1R expression in astrocytes. Conclusions There are differences in the expression of CB1R in hippocampus between newborn SD rats and adult SD rats. From birth to adulthood, hippocampal CB1R might migrate from neuronal cell bodies to synapses in rat.
[Key words] Rat;Hippocampus; Cannahinoid type 1receptor; Astrocyte; Development
内源性素（eruiocannahinoids,EC)在神经系统通过多种机制发挥作用，EC系统包含素受体，合成和降解酶等，并且同种受体在不同细胞上激活产生不同作用|1]。新皮质、海马、丘脑以及小脑均存在素I型受体（cannahinoid type 1receptor, CB1R)表达，并且CB1R主要分布于神经轴突末端，
以抑制性突触前膜最为明显，兴奋性突触前膜也有少量分布。前期研究发现癫痫持续状态后，CB1K在脑组织中的再分布与癫痫发生密切相关m。知道癫痫发生与神经系统发育密切相关，那么出生后随着神经系统发育，是否存在CB1R的表达改变呢？因此，本文探讨刚出生大鼠海马和成年大鼠海马CB1R表达及分布特点及差异，了解在大鼠神经系统发育过程中，CB1R是否存在再分布及其特点。
材料与方法
1.实验动物、试剂和仪器
刚出生 SD大鼠（parturition 0 day，P0 )和 3 个月龄SD大鼠（空军军医大学动物实验中心），清洁级，不限雌雄。CB1R抗体（Ahcam),GFAP抗体（Sigma)，Alexa Fluor594-抗小鼠 IgG (Sigma)，生物素-抗兔IgG(Sigma),Cyanine 2(CY2)( Sigma)。冷冻切片机(Leica)，正置显微镜（Olympus)，激光共聚焦显微镜（Olympus)〇
2. 海马组织标本制备
分别取P0和3个月龄SD大鼠3只，在麻醉下开胸，左心室穿刺后灌注固定。首先用生理盐水灌注冲洗l~2min，然后用含4%多聚甲醛的固定液灌注固定30min。每组3只大鼠灌注固定后取脑，后固定在30%蔗糖磷酸缓冲液（0.1 M)中，4尤过夜。切片机预冷，将大鼠脑标本固定在标本托上，固定液包埋
冷冻。从前囟向后开始进行脑冠状切片，厚12um，海马出现完全（包含CA1和CA3区）后开始留片，将切片固定在多聚赖氨酸处理的载玻片上。所有切片密封于-80丈保存，用于CB1R以及胶质纤维酸性蛋白（glial fihrillary acidic protein,GFAP)免疫组化检测。
3. 海马CB1R免疫组化检测
切片平放于玻璃盒内，用血清封闭液封闭2h，然后和兔抗大鼠CB1R抗体（1:300)反应，4丈过夜。PBS洗片后和生物素化抗兔抗体（1:300)反应，室温3h，最后和链霉素-生物素-过氧化物酶复合物孵育4T过夜，DAB显。用抗体稀释液取代一抗作空白对照。显后脱水、封片，显微镜下观察切片、
310脑勺神经疾病余忐2021年第29徬第5期
拍照。
4.GFAP和CB1R双标免疫荧光检测二苯并噻吩
大鼠海马切片进行GFAP/CB1K免疫荧光双标染
3切片于玻璃盒内平放，封闭液封闭2h，然后在
混合一抗中41过夜，混合一抗含有小鼠抗GFAP抗
体（1:1000)和兔抗CB1R抗体（1:300)。然后切片
在生物素抗兔IgG( 1:300 )中孵育4h，最后用Alexa
Fluor594-抗小鼠IgG (1:400)和 CY2 (1:500)避光孵
育4h。抗淬灭剂封片，在激光共聚焦显微镜下进行
观察、拍照。
结果
1.大鼠海马CB1R DAB免疫组化染（图1 )
注；A:3 月龄大鼠海马，A l:C A1; A2: C A3; A3: D G:A1、A2、A3为图A中al、a2、a3区域放大。B:P0大鼠海马，B1:
C A1; B2: C A3; B3:
D G。B l、B2、B3 为图 A 中 b l、b2、b3 区域 放大s.o：始层；S.p：锥体细胞层；s.r：放射层；S.1：透明层；s.m：分子 层；8來颗粒细胞层。图标=200(灰，8)4111；图标=20(人1-六3;81-83) (jl m.
图1不同年龄大鼠海马（:B1K表达
CB1R在3个月龄SD大鼠海马呈点、线状分布，与以往研究报道类似[•'这种表达特点与CB1R在抑制性突触前膜，以及轴突末端表达有关，并且这种点、线状分布，多集中在海马CA1、CA3区锥体细胞层(A1/A2)，考虑与抑制性突触主要分布于锥体细胞层有关，抑制性突触多分布在锥体细胞轴突起始部位。在齿状回，这种点、线状分布在分子层明显强于颗粒细胞层（A3 )。而P0期大鼠海马CB1K呈现片状分布，主要集中在锥体细胞胞体（B1/B2)，以及齿状回颗粒细胞胞体（B3)，以细胞核周围分布明显。胞体周围分布可以清晰显示锥体细胞和颗粒细胞轮廓。与此同时，仍有点状分布于C A i区放射层、始层，CA3区透明层，齿状回分子层，考虑与典型的突触前膜分布有关。
2.大鼠海马CB1R和GFAP双标免疫荧光（图2 )注：A、B、C (合成图）：3月龄大鼠海马C A1区；丨)、E、F (合成 阍）：P0大鼠海马C A1区G F A P：红；C B1K ：绿：C B1K在 锥体细胞胞体表达（箭头），但是在AST (G F A P阳性）中无表达：所有图像通过共聚焦显微镜获得始层；s.p：锥体细胞层；s.r：放 射层。网标=50 p m.
图2 不同年龄大鼠海马（:B1K和（;FA P双标荧光
因为作者首次发现CBlIi在神经元胞体表达，与传统突触前膜表达不同，为进一步确认此项结果，以及
除外星形胶质细胞上CBll{干扰，进行了 CB1R 和GFAP免疫荧光双标检测本文发现，3个月龄大鼠海马CA1区CB1K分布呈现点状荧光，但是以锥体细胞层点状荧光最为明® (A )；同时结果显示星形胶质细胞无CB1R表达（C )而在P0期大鼠海马CAI区，CB1R呈现片状分布，主要分布在锥体细胞胞体，核周明显（F)，与DAB敁结果一致，同时也有点状分布在始层、锥体细胞层和放射层，以放射层显著；星形胶质细胞无CB1K表达，并且发现P0期SD大鼠海马CA1区星形胶质细胞主要分布在始层（F )和分子层（图未M示），放射层不明显。
讨论
自古以来在医学上一立被当作药物使用|41，被认为是史上最古老的药用植物之•。但是由于其在精神方面的不良反应151，极大的限制了的临床应用。但是研究显示人体存在内源性素信号通路，是人体信号转导的重要调节者，因此素研究再次得到研究人员的关注内源性素通路参与脑内神经信号传导调节，与疼痛、焦虑、记忆等众多生理活动密切相关1A1内源性素系统含有受体、配体，以及合成和降解酶等，对突触传递进行负反馈调节。体内已明确的内源性素受体为G蛋白偶联受体，主要为CB1R和素n型受体（cannahinoid type 2 receptor,CB2R)。CB1R 主要分布在中枢神经系统，而(:B2I{主要分布在免疫系统CB1R在多种物种表达，并且物种之间在进化上高度保守，而CB2R进化上变异较大。在CB1R和CB2I《之外，脑内也发现内源
性素家族的其他受体,
脑与神经疾病杂志2021年第29卷第5期311
比如GPR55也是G蛋白偶联受体171，曾经认为是内源性素家族的第三种受体，但是目前对这种受体的命名仍有争议。CB1R与脑神经系统得关系更为密切，参与多种神经功能调节，内源性素在中枢神经系统的多种作用不依赖于CB2R181。
CB1R的糖基化氨基末端暴露在细胞外，而跨膜区为7个a螺旋，竣基末端则位于细胞内，可以结合G蛋白。胞内环和胞外环具有调节作用，与其他G蛋白偶联受体相同。配体绑定CB1R后，GDP转变为GTP，激活的G蛋白与受体分离，而启动下游信号。CB1R羧基末端残基，在信号调控中发挥关键作用，其含有的半胱氨酸残基，棕榈酸酰化后可以连接细胞膜，作用类似于锚，而磷酸化的丝氨酸和苏氨酸残基，可以与次级信号分子联系[9]。
CB1R主要表达于GABA能轴突终末，谷氨酸(glutamate，Glu)育旨神经兀也少量表达CB1R_。高水平CB1R在GABA能中间神经元表达，尤其是含胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK)的篮状细胞|U|。CB1R在海马、新皮质，以及小脑表达，在碱能、去甲肾上腺素能神经元轴突上也有CB1R表达，功能为抑制突触前膜神经递质释放，从而逆向调节神经传递。电镜研究表明，CB1R存在于突触前膜和轴突||21，而在树突和胞体等部位，CB1R鲜有分布，但是这些研究集中在成年动物，对刚出生动物少有涉及。对于目前已知的，所有关于哺乳动物受体，CB1R分布最为广泛，存在于各种神经元突触前膜|1
31，并且在中枢神经系统表达极为丰富。最新研究显示，CB1R 也表达于脑线粒体膜上114i，并且线粒体上CB1R有可能参与突触传递
然而，发现目前关于CB1R表达的研究，多是成年动物|161，未发现关于刚出生大鼠脑CB1R表达的研究。因此，本文选择刚出生SD大鼠海马进行免疫组化染，观察海马CB1R表达特征。发现刚出生SD大鼠和成年大鼠海马CB1R表达存在差异，刚出生SD大鼠海马CB1R主要集中在CA1/CA3锥体细胞胞体，以及齿状回颗粒细胞胞体，而不是分布在的突触前膜，因为这些区域没有呈现经典的点状分布。由于CB1K在神经元胞体表达为首次发现，为确认研究结果，进行CB1R和GFAP的免疫荧光双标检测，以除外星形胶质细胞上CB1R干扰。本文发现，3个月龄大鼠海马CA1区CB1R呈现点状分布，并且这种点状分布主要集中在锥体细胞层，星形胶质细胞无CB1R表达。而在P0大鼠海马，CB1R呈现片状聚集，主要分布在锥体细胞胞体，也有典型的点状分布，呈现在始层、锥体细胞层和放射层，以放射层显著，星形胶质细胞未呈现CB1R表达，并且发现星形胶质细胞主要分布在CA1区始层，放射层少有星形胶质细胞。鉴于海马CB1R，在刚出生SD大鼠和3月龄SD大鼠分布存在明显差异，因此，推测从出生至成年，大鼠海马CB1R存在从神经元胞体向神经突触的迁移。
都知道，CB1R主要分布在神经元突触前膜，对神经递质传递起负反馈调节，而在发育过程中，CB1R从胞体向突触的迁移如果收到干扰，必然影响突触传递的负反馈调节作用，这一结果是否和癫痫发生有关呢？值得在今后研究中进一步探讨。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明孟宪栋、李娟：临床资料整理和撰写论文
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(收稿日期：2020-08-30)
脑与神经疾病杂志202丨年第29卷第5期
•论著.
miR -34a 通过靶向CD 47激活PI 3K /A kt 途径
抑制异丙酚诱导的幼鼠海马神经元细胞凋亡
张忠杰赵立生迟淞元崔龙吉
【摘要】目的研究1^1?-343对异丙酚诱导的神经元细胞凋亡的影响，111;1?-343、（:0 47的靶向 关系及在此过程中P 13K /Akt 途径的作用。方法提取分离幼鼠海马神经元细胞，在不同浓度异丙酚（1、 10、20、40、60、80 |xg • mL —1 )处理12h ，采用MTT 法检测神经元细胞活力，流式细胞术法检测神经元细 胞凋亡情况，实时荧光定量聚合酶链反应(RT -qPCR )检测神经元细胞中miR -34;1、CD 47 mRNA 的表达水平； 将 Control 组（未转染病毒）、miR-NC 组（转染 miR-NC )、miR -34a 组（转染 miR -34a mimics )、prDNA 3.1 组（转染 pfDNA 3.1 )、miR -34a +a ) 47 组（miR -34a mimirS 和 p(、D N A 3.1-CD 47 共转染）以慢病毒法转 染至幼鼠海马神经元细胞中，并用一定浓度异丙酚处理。采用MTT 法检测各组细胞活力，流式细胞术法检 测各组细胞凋亡情况，RT -qPCR 检测各组miK -34a 、CD 47mRNA 的表达水平，Westernhlot 检测各组CD 47、P 13K 、Akt 、p -Akt 、Bax 、BH -2、Cleavfdcaspase -3蛋白的表达水平，双荧光素酶活性实验验证miR -
343对CD 47的靶向作用结果幼鼠海马神经元细胞活力及凋亡率与异丙酚浓度均成剂量依赖性，且浓度 这20 w m L /1的异丙酚作用下，随浓度的升高，细胞活力显著降低（P <0.01 )，细胞凋亡率显著升高), 在异丙酚作用后miR -34a 表达童显著降低，CI ) 47 mRNA 表达量显著升高；转染后各组细胞与Contm 丨组相比， 11^-343组细胞活性显著升高（户<0.01)，匚0 47蛋白表达量显著降低（户<0.0丨），？131<、丨1-八14丨、1?(.丨-2表 达均显著升高（/MXOl ) , Bax、Cleaved raspase -3表达均显著降低（P <0.01 ) ; CI )47为miR -34a 耙基因= 过表达a .) 47会减弱miR -34a 抑制异丙酚诱导的神经元细胞凋亡作用：结论nliR -34a 可通过耙向负调控
CD 47并有效抑制异丙酚诱导的神经元细胞凋亡，其可能的作用机制为激活PI 3K / Akt 通路3
【关键词】miR -34a ; CD 47；幼鼠海马神经元；细胞凋亡；丨M 3K /Akt 途径 中图分类号：R 741 文献标识码：A 文献编号：1006-351X ( 2021 ) 05-0312-08
MiR-34a inhibits propofol-induced apoptosis of hippocampal neurons in young rats by activating PI3K/Akt pathway through targeting CD 47
Zhang Zhongjie, Zhao Lisheng, Chi Songyuan, Cui Lmgji
Department of A nesthesiology,the Affiliated Hospital of North China University, Jilin 132000, China Correspondingauthor:ZhaoLisheng,Email:****************
[Abstract] Objective To investigate the effect of m iR -34a on propofol—inrlured neuronal apoptosis, and to旅游网站论文
explore the targeting relationship of m iH -34a and CD 47 and the role of PI3K/Akt pathway in this process. Methods
作者单位：132000吉林，北华大学附属医院麻醉科 通信作者：赵立生，Email : 281793862@qq 。
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