想做多重免疫荧光？收好指南，教你一张片子染出七种颜 想做多重免疫荧光？需要先思考这几个问题：
问题 1：你认得全动物园里的动物们吗，比如大鼠，小鼠，兔，山羊，绵羊，鸡，荷兰猪（豚鼠）？不同种属的抗体需闹清楚。问题 2：你确定能分得清字母表并做得了十以内得加减法吗？有不同亚型鉴定的过的一抗，比如：IgG1， IgG2a， IgG2b， IgG2c，IgM， IgE 不知道怎能行？ 问题 3：你确定能将动物和数字字母们对号入座，并对门牌吗？有对应种属特异反应性的 Fab 二抗，比如：F(ab')2 Fragment（避免 Fc 反应性出现的非特异染），Cross adsorbed（抗体纯化过程交叉吸附，避免物种交叉反应带来的背景）。问题 4：你确定能将重峦叠嶂移出两山排闼吗？选择合适的荧光素，明辨激发光和发射光，且不会导致荧光背景增强，比如：FITC、PE、Cy、Alexa Fluor、DyLight。就算上面的问题你都能搞定，订购来了各种试剂，准备来了片子，你就一定能染出来多重颜？你只是迈开了万里长征的第一步而已。因为要得到理想的荧光实验结果，每一个步骤都需深 (wā) 度 (kēng) 优 (mái) 化 (tǔ)，固定通透方法、浓度配比、抗体共孵育、抗体稀释液、封闭条件等等。此时，有人在你发际线还没有升高，头发还乌黑浓密的时候，在你的耳边悄 悄跟你说：做多重荧光简单，有种快捷省时的方法。先让你们随意感受一下这种方法染出来的图片：接下来我们将仔细介绍该方法实验原理和实验步骤。
多重荧光免疫组化（mIHC）实验原理
上述方法采用 TSA 技术 (Tyramide Signal Amplification?，酪胺信号放大技术)：简单来说，用该方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。
荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用 TSA 技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。 荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜通道以上，这种情况下发射光谱会重
叠，我们可以借助多光谱成像系统来解决这个问题。这是传统间接荧光法染和显法多重免疫组化所做不到的。而且还能真实反映关键蛋白的表达情况和相互之间的关系，从而极大地节约珍贵的样品。
使用 TSA 技术，你需要准备：
1. 严格验证的高特异性抗体：所有 CST 快乐无极的 IHC-P 验证过的抗体都满足mIHC（多重荧光免疫组化）高特异性的要求。
2. HRP 偶联的针对一抗种属亚型特异的二抗。
3. 酪胺荧光素 (PerkinElmer, Thermo Fisher Scientific 等供应商)。
背光驱动
4. 多光谱成像系统 (PerkinElmer 等)。
四事具备，你就可以开始尝试进行 TSA 的多重荧光组化染了。好炫的 mIHC 结果，比如：或者：如何做到呢？除了优质的抗体，还需要优化的实验方案和抗体配比，比如：如何配比抗体，如何选择荧光素等。 CST 研发科学家利用 CST 七叶和茶的优质抗体，在这个领域也
花了很多功夫来尝试，强大的研发团队目前已经将已有方案优化到了 7 ！所以荧光染染出七光再也不是传说，七光不是传说，不是传说！ 而且实验方案、抗体配比全部免费开放给大家，免费开放，免费！下面容我直接带你们收获一下胜利果实吧，请看优化好的多重荧光免疫组化（漆膜附着力测定法>压缩天然气密度mIHC）实验操作步骤：
多重荧光免疫组化（mIHC）实验操作步骤
首先，我们来解读一下 CST 采用的基于 TSA 的 mIHC 实验优化原则，我们以人浆液性卵巢癌的石蜡切片样本染 PD-L1、B7-H4、FoxP3、CD8alpha 和 CK 的 mIHC 优化流程为例介绍如何优化。
基本方法
1. 切片脱蜡、复水 2. 抗原修复：优化抗原修复流程，尽可能最大程度修复抗原。 3. 抗体浓度优化：染前优化抗体稀释度，提高每一个靶点的检出率和信噪比。 4. 染：用 SignalStain? Antibody Diluent #8112 稀释一抗，然后用对应的 SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP，Mouse) #8125 或 (HRP， Rabbit) #8114 作为二抗孵育，使用
荧光素反应染。 5. 拍照分析：用党员二楞妈 Nuance? 多光谱成像系统（PerkinElmer 公司）拍摄，也可使用其他多光谱成像系统如 Vectra?， Mantra? 等，并用配套 inForm? Tissue Finder? 模式识别软件进行成像分析。
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