靶向CD20和HLA-DR分子Crossmab的设计与构建表达
曾静;王津京;刘然;郑丹;方毅
【摘 要】目的 设计、构建与表达靶向CD20和HLA-DR分子的Crossmab双特异性抗体.方法 设计靶向CD20和HLA-DR分子的Crossmab双特异性抗体分子,命名为CD20-HLA-DR CrossmabcH1-cL,利用基因工程技术构建Crossmab四条链的真核表达载体,然后利用FreeStyle 293-F Cells哺乳动物细胞表达体系表达CD20-HLA-DRCrossmabcH-CL.结果 获得了CD20-HLA-DR CrossmabcH-CL抗体分子蛋白.结论 成功设计、构建、表达并初步鉴定了靶向CD20和HLA-DR分子的双特异性抗体CD20-HLA-DR CrossmabcH1-CL,为研制新型抗肿瘤的双特异性抗体药物打下了基础. 【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2014(021)005
【总页数】7页(P557-563)
【关键词】厦门px事件双特异性抗体;CD20;HLA-DR;淋巴瘤
【作 者】曾静;王津京;刘然;郑丹;方毅
【作者单位】军事医学科学院附属医院内分泌与代谢病科,北京100071;军事医学科学院附属医院内分泌与代谢病科,北京100071;军事医学科学院附属医院内分泌与代谢病科,北京100071;军事医学科学院附属医院内分泌与代谢病科,北京100071;军事医学科学院附属医院内分泌与代谢病科,北京100071ifix>蛋氨酸铬
【正文语种】中 文
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)可以同时特异性结合两个不同的抗原，由于其双特异性和多功能性，在免疫中发挥越来越重要的作用。BsAb自然状态下不存在，只能通过人工方法进行制备。基因工程抗体技术的发展，为BsAb的研制奠定了基础。Crossmab是一种二价全长IgG样双特异性抗体，它运用“knobs-into-holes”技术(“杵臼”技术)将两个重链组装成异源二聚体［1-4］，一侧抗体臂保持不变，用“crossover”技术(“交叉”技术)将双特异性抗体另一侧抗体臂的轻链和同源重链在Fab上的结构域进行交换。交叉后保持抗原亲和力不变，但避免了轻链错配［5-7］。 全国党校工作会议
抗CD20抗体Rituximab是美国食品和药物管理局批准的第一个用于B细胞淋巴瘤的性单克隆抗体。Rituximab单药或联合化疗对一部分B细胞NHL患者常常无效，且会出现Rituximab抵抗［8］。HLA-DR在多种造血系统恶性肿瘤(包括B细胞NHL)中高表达，引起人们探索基于抗HLADR单克隆抗体免疫淋巴瘤的兴趣［9-13］。hL243γ1是一种抗HLA-DR α链表位的人源化单克隆抗体。有研究报道，hL243γ1可通过直接诱导细胞死亡的机制杀伤肿瘤细胞［14］。
本研究以靶向CD20的单克隆抗体Rituximab和靶向HLA-DR的单克隆抗体hL243γ1作为亲本抗体，构建、表达并初步鉴定了同时靶向CD20和HLADR 分子的 BsAb，CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL，为下一步研制新型抗淋巴瘤的靶向抗体药物打下了基础。
材料与方法
1 材料
CMV/R-IgG1载体和CMV/R-IgKappa载体由本实验室自行构建保存;DH5α感受态细胞购自北京博迈德科技发展有限公司;FreeStyleTM293-F细胞株及Ramos和Raji淋巴瘤细胞株由本
室保存;hL243γ1轻、重链可变区基因由南京金斯瑞公司合成，分别亚克隆到了CMV/R-IgKappa载体和CMV/R-IgG1载体上;PCR引物由Invitrogen公司和北京天一辉远合成，PAGE纯化;限制性内切酶AgeI-HF，BamHI-HF均为美国 NEB公司产品;CloneEZ PCR Cloning Kit购自南京金斯瑞生物科技有限公司;Phusion超保真PCR试剂盒购自美国NEB公司;小量质粒抽提纯化试剂盒及快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司;Hispeed Plasmid Maxi kit购自Qiagen 公司;D2000 Marker、MarkerI、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为天根生化科技(北京)有限公司产品;Gibco®FreeStyle 293 Expression Medium及无血清培养基OPTI-MEMI为Life Technology公司Gibco产品;PEI购自北京乐博生物科技有限公司，Polysciences产品;30kDa超滤管为 Millipore公司产品;Protein A购自Amersham公司。
2 CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL结构的设计
以抗CD20分子的单克隆抗体Rituximab和抗HLA-DR分子的单克隆抗体hL243γ1为亲本抗体，设计双特异性抗体 CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL。本研究设计了下面四条链:其中一侧抗体臂来源于Rituximab，将Rituximab的一条原始重链1设计一个knob结构，在Fc上引入T389W突变，再引入一个半胱氨酸残基S377C;Rituximab一条原始轻链1不变;另一
侧，以hL243γ1为亲本抗体，设计了一个新的改造后的重链2和一个新的改造后的轻链2，重链2从C端到N端由hL243γ1原始重链Fc和hL243γ1原始轻链的CL及hL243γ1原始重链的VH组成，并引入三个“hole”突变(T393S，L395A，Y434V)和一个半胱氨酸残基(Y376C突变);而新的轻链2从C端到N端则由hL243γ1原始重链的CH1和hL243γ1原始轻链的VL组成。由于改造后的重链和轻链的各个结构域之间是相互交叉的，因此用“crossover”这个词来描述这种各结构域的交换，并用“Crossmab”来命名基于这种技术构建的双特异性抗体。通过结构域的重排，避免了抗体表达时出现的副产物组装，“crossover”侧新的轻链2由于还包含了重链的CH1部分，因此不能和原始的重链 1组装。另外，“crossover”侧的新重链2也不能和原始轻链1组装，因为这两条链都含有CL部分。且上述两个半胱氨酸残基使两个抗体臂的轻、重链间形成稳定的二硫键，保证轻、重链的正确组装。这样本研究就构建出了一个新型的双特异性抗体，该抗体的两个Fab都有正确的轻重链配对，而且物理结构上和经典的“Y”型IgG分子几乎没有差别。构建示意图如图1所示。
图1 基因工程设计四价抗体CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL示意图VH:重链可变区;CH1:重链恒定区1;VL:轻链可变区;CL:轻链恒定区;light chain1:Rituximab来源轻链;heavy chain1:Rituximab来源重链引入knob结构;light chain2:hL243γ1来源轻链;heavy chain2:hL2
43γ1来源重链，引入 hole结构;“knobs-into-holes”:“杵臼”技术;“crossover”:“交叉”技术。
粟裕战争回忆录3 CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL四条链的合成及构建
3.1 原始轻链1，即Rituximab原始轻链，质粒由本室保存。原始重链1，即Rituximab原始重链引入一个knobs结构(T389W突变)和一个半胱氨酸残基(S377C突变)，由金唯智公司合成。新的重链2从C端到N端由hL243γ1原始重链Fc区和hL243γ1原始轻链CL区及hL243γ1原始重链的VH区组成，引入“hole”三个突变 (T393S，L395A，Y434V)到 hL243γ1的重链，引入半胱氨酸残基(Y376C突变)到hL243γ1“hole”突变重链上，由金唯智公司合成。新的改造后轻链2从C端到N端，由hL243γ1原始重链的CH1和hL243γ1原始轻链的VL组成。
3.2 新的轻链2通过基因克隆技术构建而成，构建过程如图2所示。引物由Invitrogen公司合成，先将hL243γ1原始重链CH1区和 hL243γ1原始轻链VL区+信号肽(signal peptide，SP)进行PCR扩增反应，反应产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，然后将PCR产物回收纯化，再将hL243γ1原始重链的CH1和hL243γ1原始轻链的VL区+信号肽两个片段重叠PCR(overlapping PCR)进行连接，再次电泳及PCR产物回收纯化，CMV/R-IgG1vector载体由AgeIHF及BamHI-HF双酶切，进行片段回收，将目的片段与载体用CloneEZ PCR Clo
ning Kit进行同源重组(homologous recombination)，转化 DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序鉴定。新的轻链2/CMV/R-IgG1表达载体质粒由Hispeed Plasmid Maxi kit提取后用于后续转染。
4 CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL的表达、纯化与鉴定
FreeStyle293-F细胞在FreeStyle293 Expression Medium中培养，摇床转速125rpm，37℃，10%CO2。培养到第 5代用于转染。将FreeStyleTM293-F细胞密度调整在1×106/mL，活细胞比例达到90%。加入100mL细胞悬液到250mL细胞摇瓶中。将CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL四条链表达载体质粒 DNA按照1∶1∶1∶1的比例，共100μg，溶于 Opti-MEMI。加入转染试剂 PEI 200μg(比例为 PEI∶DNA=2mg∶1mg)到 DNA 溶液。室温孵育20min。将DNA/PEI混合液加入到培养细胞中。将细胞放置于摇床上，匀速125 rpm摇动，37℃，10%CO2培养。转染7天后检测细胞活力下降到50%以下，即收集细胞培养上清，转至无菌瓶中4℃保存，用 Protein A亲和层析(GE Healthcare公司)纯化抗体。Nanovue:Protein A280进行浓度测定。纯化后的CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL分别在非还原(6%浓度)和还原(12%浓度)条件下用聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染鉴定抗体，检测其纯度和分子量大小。
5 CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL生物学功能的初步检测
图2 CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL改造后的轻链2构建示意图
5.1 与淋巴瘤细胞的结合活性 对数生长期Raji细胞，计数，PBS洗涤，调整细胞密度至1×105/mL。将细胞悬液加入流式检测管中，100μL/管。用1%BSA-PBS将 Rituximab、11B8(Ⅱ型抗 CD20抗体)、hL243γ1 及 CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL分别倍比稀释。将稀释后的抗体分别加入Raji细胞，100μL/管，每一浓度均设复管，PBS为空白对照。细胞冰浴45min。用1%BSA-PBS 100μL洗两遍。加入 Alexa Fluor® 488 goat anti-human IgG(H+L)，避光冰浴45 min。用1%BSA-PBS洗三遍。细胞用300μL PBS重悬，流式细胞仪检测。
5.2 诱导淋巴瘤细胞凋亡的检测 对数生长期Raji细胞，计数。分别将细胞种于48孔板，300μL/孔，密度为 2.5 ～3 ×105/mL，分别加入Rituximab、11B8(Ⅱ 型 抗 CD20 抗 体)、hL243γ1、Rituximab+hL243γ1(各 5μg/mL)、及 CD20-HLADRCrossMabCH1-CL各10μg/mL，每种抗体均设复孔，抗HER2单克隆抗体作为阴性对照。48h后收集细胞，PBS洗涤两遍，用SYTOX®Red dead cell stain室温避光染15min，流式细胞仪检测。
5.3 统计分析 采用SPSS13.0软件进行数据处理。
实验结果
壮族姑娘出嫁为什么要穿黑嫁衣?1 CD20-HLA-DR CrossmabCH1-CL的设计及构建
全基因合成2条链:重链1来源于Rituximab重链，带有一个knob结构(T389W突变)和半胱氨酸残基(S377C突变);改造后的重链2由hL243γ1原始重链Fc区，hL243γ1原始轻链的 CL区及 hL243γ1原始重链的VH组成(由C端到N端)，并引入三个“hole”突变 (T393S，L395A，Y434V)和一个半胱氨酸残基突变(Y376C突变)到hL243γ1的重链上。另外，Rituximab的一条原始轻链1保持不变;新的改造后的轻链2由hL243γ1原始重链CH1的N末端通过重叠PCR的方法直接与PCR克隆出的hL243γ1原始轻链VL的C末端融合，PCR产物电泳图，如图3所示。
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