翟荣荣;蒋金凤;张济;丁永斌;王建华;魏继福
【摘 要】目的:建立获取和培养人原代肥大细胞的方法,为探讨肥大细胞的免疫调节作用及其机制奠定基础.方法:用重组人源干细胞因子、IL-6和IL-3刺激CD34+造血干细胞使之分化成肥大细胞；Percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选法,分离肠道黏膜肥大细胞.应用免疫荧光染技术分析所获得的原代肥大细胞表面分子CD117和FcεRⅠ,甲苯胺蓝染或间接免疫荧光染检测胞内类胰蛋白酶含量.结果:黏膜肥大细胞及CD34+造血干细胞刺激分化而来的肥大细胞均表达CD117和FcεRⅠ,胞内均含有类胰蛋白酶.结论:这两种方法均可以有效地获得大量纯化的原代肥大细胞,且各有优势,所得细胞适用于肥大细胞在机体免疫调节和病原防御等生理功能的后续研究.%Objective:To establish the technique for generation or isolation of human primary mast cells,and for further studying their roles in regulating host immunity and elucidating immunopathogenesis.Methods:CD34 + hemopoietic stem cells were cultured in presence of stem cell factor,IL-6,and IL-3 to generate primary mast cells.Mast cells allocated in human intestinal tissues were isolated through digestion,density gradient centrif ugation and purification with specific antibodies-coated magnetic beads.Cell phenotype was monitored by immuostaining of surface markers of CD117 and FcεRⅠ and intracellular tryptase,or cells were identified with Toluidine blue staining.Results:Both of the CD34 + cell-derived and intestinal mast cells expressed CD117 and FcεRⅠ,the specific markers for mast cells,and contained intracellular tryptase.Conclusion:Both methods could provide sufficient and purified primary mast cells for further study in regulating host immune response and defence against pathogenic microorganism.
【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2013(023)003
唐汉中医药网【总页数】5页(P224-228)
【关键词】肥大细胞;肠道黏膜;类胰蛋白酶;诱导
安全责任 重在落实
【作 者】翟荣荣;蒋金凤;张济;丁永斌;王建华;魏继福
【作者单位】南京医科大学第一附属医院药学部研究室,江苏南京210029;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;南京医科大学第一附属医院普外科,江苏南京210029;南京医科大学第一附属医院普外科,江苏南京210029;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;南京医科大学第一附属医院药学部研究室,江苏南京210029
【正文语种】中 文
【中图分类】R329.2
肥大细胞是定位于组织的一类胞质内富含嗜碱性颗粒的细胞［1］，与哮喘、变态反应等疾病的发生密切相关。近年来，肥大细胞在调节机体免疫、防御病原微生物入侵等方面的作用正在引起人们的关注。目前主要采用HMC-1，一种从肥大细胞淋巴瘤(mast cell leukaemia)患者中分离转化的细胞系研究肥大细胞。HMC-1与机体生理条件下肥大细胞的差异，限制了对肥大细胞功能的深入研究。鉴于此，我们建立了两种人原代肥大细胞的体外诱导培养和分离方法，两法均可获得纯度较高、状态良好的肥大细胞，可适用于肥大细胞在免疫调节和病原防御中作用的后续研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和组织 健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)购于上海市血液中心;直肠和(或)结肠组织由南京医科大学第一附属医院普外科提供。患者签署知情同意书，并获得南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准。
1.1.2 主要试剂和抗体 β-巯基乙醇和 RPMI 1640培养基(Gibco公司)，胶原蛋白水解酶Ⅰ型和甲苯胺蓝(Sigma公司)，透明质酸酶(Worthington公司)，脱氧核糖核酸酶(DNase)Ⅰ型(Roche公司)，Percoll分离液(GE公司)，抗CD34抗体包被的磁珠、抗CD117抗体包被的磁珠和MACS细胞分选缓冲液(Miltenyi公司)，重组人源干细胞因子(Stem cell factor，SCF)、IL-6 和 IL-3(R＆D 公司)，类胰蛋白酶抗体(Millipore公司)，荧光封片试剂(DAKO公司)，APC(Allophycocyanin)标记的抗人CD117抗体(Biolegend公司)，APC标记的抗人 FcεR I抗体(eBioscience公司)，藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗人CD4抗体、APC标记的抗人CXCR4抗体、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗人CD34抗体和APC-cy7标记的抗人CCR5抗体(BD公司)。童年的发现教案
1.2 CD34+细胞向肥大细胞的诱导分化
根据Saito等［2］描述的方法分离 CD34+细胞。PBMC中加入相应量的抗CD34抗体包被的磁珠，4℃孵育30 min，用MACS细胞分选缓冲液洗涤2次，重悬细胞，过MACS细胞分选柱(规格:LS)进行分选，收集CD34+细胞。将CD34+细胞用含100 ng/mL SCF、50 ng/mL IL-6和5 ng/mL IL-3的 RPMI-1640(含10%胎牛血清)培养基［3］培养1周后，更换为含100 ng/mL SCF和50 ng/mL IL-6的培养基培养，以后每周半量换液，细胞密度保持在2×105/mL。培养4周作为肥大细胞前体(progenitor mast cells)，培养11周作为成熟的肥大细胞。
1.3 分离人肠道黏膜细胞
取直肠癌或结肠癌患者手术后的无病变组织，用含高浓度抗生素(1 000 U/mL青霉素、1 000 U/mL链霉素、5%甲硝唑和2%庆大霉素)的 Hank's平衡盐溶液(HBSS)洗涤组织，除去表面血迹，剥离肠道表面的脂肪和结缔组织;纵向剖开肠道，将组织置于无菌纸上，吸去黏膜表面多余黏液，然后剥离黏膜组织，在HBSS液中洗涤，直至液体澄清;将组织剪成1 cm3小块，放入含2 mmol/L EDTA/7 mmol/L β-巯基乙醇的 HBSS液，37℃，60 r/min磁力
搅拌10 min，洗涤2次，再放入含5 mmol/L EDTA的HBSS液，37℃，60 r/min磁力搅拌20 min，洗涤1次，然后转入含5%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640溶液，37℃，60 r/min磁力搅拌30 min，平衡组织中Ca2+和Mg2+;接着将组织剪成1 mm2，加入含5%FBS、75 U/mL 胶原酶(0.278 mg/mL)、72 U/ml透明质酸酶(0.1 mg/mL)和 50 U/mL脱氧核糖核酸酶(0.025 mg/mL)的 RPMI-1640培养基中消化组织4次，将收集的单细胞悬液混合，过 100目尼龙网，400×g离心 10 min，1 mmol/L EDTA-PBS溶液重悬细胞，细胞密度保持在107/mL左右。
1.4 Percoll密度梯度离心富集细胞
在50 mL离心管中依次加入12 mL 1.119 g/mL Percoll分离液和 1.077 g/mL Percoll，然后加入24 mL上述肠道黏膜细胞悬液，700×g，升降速为0，离心10 min，单个核细胞位于1.077 g/mL Percoll上层，粒细胞位于1.077 g/mL和1.119 g/mL Percoll交界处。收集粒细胞，用5倍体积的含5%FBS和1%Pen/strep的RPMI 1640溶液洗涤，200×g离心10 min，重复1次，MACS缓冲液重悬细胞。
1.5 抗CD117抗体包被的磁珠纯化肥大细胞
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MACS缓冲液重悬细胞，加入相应量抗CD117抗体包被的磁珠，4℃，孵育15 min，MACS缓冲液洗涤2次，重悬细胞，过LS柱，收集CD117阳性细胞，用含100 ng/mL SCF和50 ng/mL IL-6的RPMI-1640(含10%胎牛血清)培养基进行培养。
袁静波1.6 肥大细胞的鉴定
1.6.1 甲苯胺蓝染 肥大细胞贴片，用4%低聚甲醛固定，再用酸性甲苯胺蓝染60 min，流水冲至无，封片，在光学显微镜下观察。
1.6.2 免疫荧光染 肥大细胞贴片，4% 低聚甲醛固定，0.1%Triton-10%牛血清白蛋白-PBS封闭破膜，室温1 h，洗涤，加鼠抗人类胰蛋白酶抗体，4℃，孵育过夜;洗涤，Alexa Fluor 488绿荧光二抗室温孵育1 h，洗涤，DAPI染5 min，洗涤，封片，用德国Leica公司激光共聚焦显微镜(SP5)观察。
1.6.3 流式细胞术(FCM)检测表型 加入抗人CD34、FcεRⅠ、CD117、CD4、CXCR4 和 CCR5 抗体，4℃孵育15 min，PBS洗涤2次，重悬细胞后用BD公司的流式细胞仪LSRⅡ进行检测。
2 结果
2.1 CD34+干细胞的分离与肥大细胞的诱导
CD34是造血干细胞表面标志物，用抗CD34包被的磁珠分离PBMC中的CD34+干细胞。流式细胞仪分析表明，CD34+细胞的纯度高达80%～90%，见图1。台盼蓝拒染显示，细胞活力约为95%。
类胰蛋白酶在肥大细胞中含量高，且具有高度选择性［4］，因此可作为此处的鉴定指标。由图2可以看出，刚分离出的CD34+细胞，类胰蛋白酶荧光染阴性。诱导培养4周后，即成为前体肥大细胞，此时类胰蛋白酶阳性细胞已经出现，且百分率较高。随着培养时间的延长，前体肥大细胞逐渐成熟，11周后，单个细胞中的类胰蛋白酶表达量进一步提高，且细胞阳性率接近百分之百。
图1 CD34+细胞的分离Fig 1 Isolation of CD34+cells
混凝土氯离子图2 CD34+细胞来源的肥大细胞内类胰蛋白酶的表达(免疫荧光染×63)Fig 2 Tryptase expression in CD34+cell-derived mast cellDAPI为细胞核染;DIC为微分干涉显微成像
2.2 肠道黏膜组织分离的肥大细胞
先将肠道黏膜组织制成单细胞悬液，经抗CD117抗体包被的磁珠分选后获得成熟肥大细胞。甲苯胺蓝可将肥大细胞胞内颗粒染成紫红，核染成浅蓝，以此鉴定肥大细胞［5］和分析分选效果(图3)，黏膜组织单细胞悬液中偶见肥大细胞，而免疫磁珠分离后的细胞则大多呈甲苯胺蓝染阳性。
2.3 肥大细胞胞内类胰蛋白酶和膜表面分子标志物
肥大细胞的功能有赖于其胞内的生物活性介质(如类胰蛋白酶)和膜表面CD117和FcεRⅠ的表达水平。图4显示，类胰蛋白酶荧光染，CD34+细胞来源的成熟肥大细胞虽然比前体肥大细胞的荧光强度略高，但两者都明显弱于肠道黏膜肥大细胞。流式分析显示相似的结果(图5)，培养4周和11周的肥大细胞不再表达干细胞分子标志CD34;CD117和FcεRⅠ虽有表达，但表达率低于肠道黏膜肥大细胞。
图3 肠道黏膜组织分离出的肥大细胞(甲苯胺蓝染×100)Fig 3 Mast cells isolated from human intestinal
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