摘要
已分化的细胞能通过将核物质转移入卵母细胞或与胚胎干细胞融合而重编程至胚胎细胞样状态。我们对诱导这种重编程过程的因子知之甚少。在这里，我阐述了通过四个因子，Oct3/4, Sox2, c-Myc,and Klf4，在胚胎干细胞培养条件下将鼠胚胎或成体纤维母细胞向多能干细胞的诱导。出乎意料的是，Nanog不是必须的。这些细胞被我们称为诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell,iPS cell)，它们表现出胚胎干细胞(embryonicstem cell,ES cell)的形态和属性，并且表达胚胎干细胞的标记基因。将iPS cells皮下注射转移至裸鼠导致包含所有三个胚层的一系列组织的肿瘤的形成。接下来将其注射进入鼠囊胚，iPS cells导致了鼠胚胎的发育。这些数据证明，多潜能干细胞能通过仅仅添加一些确定的因子而从纤维母细胞培养物中直接生成。 简介
起源于哺乳动物囊胚内细胞团的胚胎干细胞维持在多潜能性时具有无限生长的能力，并且能分化成三个胚层内的的所有细胞( Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981)。人类胚胎干细胞被认为能许多疾病，例如Parkinson’s disease，spinal cordinjury, and diabetes (Thom
son et al., 1998 )。尽管如此，就像病人移植后组织排斥反应的问题一样，人类胚胎的使用面临着巨大的伦理困难。避免这些问题的唯一途径是从病人自体细胞直接生成多潜能细胞。
体细胞能够通过将核物质转移进卵母细胞( Wilmut et al., 1997)或与胚胎干细胞融合(Cowanet al., 2005; Tada et al., 2001 )而重新编程。这表明未受精的卵子和胚胎干细胞含有能授予体细胞生物全能性或多潜能性的因子。我们假设这些因子在维持胚胎干细胞的特性方面起重要作用，在体细胞多潜能性的诱导中也起关键作用。
数个转录因子，包括Oct3/4 (Nichols et al., 1998; Niwa et al., 2000), Sox2 ( Avilion etal., 2003),and Nanog ( Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003)，对早期胚胎和胚胎干细胞多能性的维持有作用。一些在肿瘤组织中经常表达上升的基因，如Stat3 (Matsuda et al.,1999; Niwa et al., 1998 ), E-Ras ( Takahashiet al., 2003),c- myc ( Cartwright et al., 2005), Klf4 ( Li et al., 2005), and b-catenin (Kielman et al., 2002; Sato et al., 2004)，已被显示能使胚胎干细胞表型长效维持，并在培养中使胚胎干细胞快速繁殖。此外，我们还鉴定了其他数个在ES细胞上特异表达的基因杂志制作软件( Maruyama etal., 2005; Mitsui et al., 2003)。
在这个试验中，我们检查了是否这些因子能在体细胞中诱导多潜能性。通过结合四个被挑选出来的因子，我们能从鼠胚胎或成体纤维母细胞培养物中直接产生多潜能细胞，我们称之为诱导多能干(iPS)细胞。
结果
我们假设一些因子在胚胎干细胞特性的维持中起重要作用(see Table S1 in the Supplemental Data available with this articleonline)，基于此假设，我们选择24个基因作为诱导体细胞多潜能性的因子的候选基因。对于b -catenin, c-Myc, and Stat3，我们用了活性的形态，S33Y- b-catenin (Sadot et al., 2002 ), T58A-c-Myc ( Chang et al.,2000 ), and Stat3-C ( Bromberg et al., 1999)，respectively。因为先前已报道的Grb2腾讯迷你网首页在多潜能干细胞中的负性作用(Burdon et al., 1999; Cheng et al., 1998)，我们诱导了它的dominant-negative突变体Grb2 #SH2(Miyamoto et al., 2004)作为24个候选基因之一。
为了对这24个候选基因进行评估，我们发展了一套检测系统，在这个系统里面，多潜能状态的诱导可以作为G418的抵抗被检测出来( Figure 1A)。我们通过同源重组插入了一个βgeo cassette (β-半乳糖胺酶和新霉素抗性基因的混合物)到鼠Fbx15基因中( Tokuzawa et
al.,2003)。虽然在鼠胚胎干细胞和早期胚胎中特异性表达，Fbx15却不是鼠发育和多潜能性维持所必须。被βgeo敲除构建的胚胎干细胞纯合子( Fbx15βgeo/β geo)对非常高浓度的G418 (up to 12 mg/ml)具有抵抗力，而来源于Fbx15βgeo/β geo小鼠的体细胞则对标准浓度的G418 (0.3 mg/ml)敏感。我们预期Fbx15位点的部分活化都将导致对标准浓度G418的抵抗。
我们通过逆转录病毒转导，从Fbx15βgeo/β geo胚胎将24个候选基因的每个都引入了小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)(Morita et al., 2000)。然后将重组的细胞放在STOfeeder cells in ES cell medium containing G418 (0.3 mg/ml)中培养。尽管如此，我们没有获得任何含有单一因子的药物抗性克隆，这意味着单个候选基因不足以活化Fbx15位点(Figure 1 B; see alsoTable S2, which summarizes all of the transduction experiments in this study)。
与此相反，转导所有24个候选基因在一起却产生了22个G418-抗性克隆(Figure 1 B)。继续选择性培养其中的12个克隆，5个克隆表现出与胚胎干细胞相似的形态，包括浑圆的外形、较大的核仁和较少的胞浆(Figure 1 C)。我们重复这个实验，观察到29个G418-抗性克隆，并从中挑选出6个克隆。其中的四个具有与胚胎干细胞相似的形态和增殖属性(Figure 1
D)。这些细胞的倍增时间(19.4,17.5, 18.7, and 18.6hr)与胚胎干细胞(17.0 hr)相等。我们用iPS-MEF24特指这些细胞‘‘pluripotentstem cells in-duced from MEFs by 24 factors’’。反转录PCR (RT-PCR)分析显示iPS-MEF24表达胚胎干细胞标记，包括Oct3/4,Nanog , E-Ras , Cripto , Dax1, and Zfp296 ( Mitsui etal.,2003) and Fgf4 ( Yuan et al., 1995 )( Figure 1 E)。重亚硫酸盐基因组测序证实Fbx15的启动子和Nanog在iPS 细胞中被去甲基化了( Figure 1 F)。与之相反的是，Oct3/4启动子在这些细胞中保持着甲基化状态。这些数据预示着这24个候选因子的某些组合诱导了MEF培养物中胚胎干细胞标记基因的表达。
下一步，为了明确这24个候选基因中哪些是关键的，我们检查了从构成G418-抗性克隆的转导候选基因中去除单个因子的影响( Figure 2 A)。我们鉴定了10个因子(3, 4, 5, 11, 14, 15, 18, 20, 21, and22),单个这些因子从转导组合中的移除会导致转导后10天内没有任何克隆形成，或转导后16天形成少量的克隆。单独这10个基因的组合产生了更多的胚胎干细胞样克隆，超过将24个基因都转导后所产生的数量( Figure 2 B)。
接下来我们从转导入MEFs中的10个因子中去掉其中的一个，然后检查形成的细胞克隆(Figure 2 B)。当Oct3/4 (factor14) 或 Klf4 (factor 20)被移除后，就没有G418-抗性克隆形
成。移除Sox2 (factor15)会导致只有少量G418-抗性克隆形成。当我们移除c-Myc (factor 22), G418-抗性克隆确有出现，但却是扁平的，与胚胎样干细胞不同的形态。其他因子的移除并没有显著影响克隆的数量。这些结果表明Oct3/4, Klf4,Sox2, and c-Myc在MEFs形成iPS细胞过程中起重要作用。
这四种基因的结合产生了很多G418-抗性克隆，并且与观察到的利用10个基因形成的克隆数量相似(Figure 2 C)。我们分别从两种转导物中各自挑选了12个克隆并继续培养，建立了4 iPS-MEF4 和 5 iPS-MEF10两种克隆。此外，我们可以用野生型的c-Myc代替T58A mutant产生iPS cells (iPS-MEF4wt) ( Table S2 )。这些数据证明了iPS细胞能通过四个转录因子（Oct3/4,Sox2, c-Myc, and Klf4）从MEF culture中诱导产生。
两个因子的组合不能诱导G418-抗性克隆的产生( Figure 2C)。三个因子的两种组合—Oct3/4, Sox2, and c-Myc (minus Klf4) 或者 Klf4, Sox2, and c-Myc (minus Oct3/4)—都形成了一个单个的小克隆，但却并不能在培养中维持。我们观察到Oct3/4,Klf4, 和Sox2 (minusc-Myc)新三国穿帮的组合形成了36个G418-抗性克隆，尽管如此，它们却呈现出一种扁平的，与胚胎干细胞不同的形态。Oct3/4, Klf4, and c-Myc (minus Sox2)的组合形成了54个G418-
抗性克隆，我们从中挑取了6个。尽管这6个克隆能维持several passages，但是这些细胞(iPS-MEF3)的形态却有别于iPS-MEF4 和iPS-MEF10，因为iPS-MEF3克隆有着粗糙的表面(Figure 2 D)。这些资料表明，Oct3/4, c-Myc,and Klf4组合能活化Fbx15位点，但是这三个因子诱导的改变与iPS-MEF4 或 iPS-MEF10 有区别。
我们运用RT-PCR去检验ES细胞标记是否在iPS细胞中表达(Figure 3 A)。我们使用了能扩增转录内源性基因而不能转录已转导基因的引物。iPS-MEF10 和 iPS-MEF4克隆表达了除Ecat1之外的主要标记基因( Mitsui etal.,2003)。包括Oct3/4在内的多个标记基因在iPS-MEF4-7, iPS-MEF10-6,和 iPS-MEF10-7克隆中的表达量要高过其他的克隆。Sox2仅仅表达于iPS-MEF10-6中。iPS-MEF4wt克隆同样表达多种ES细胞标记基因( Figure S1 )。染质免疫沉淀分析表明Oct3/4和 Nanog启动子的histone H3乙酰化增加而lysine 9of histone H3的二甲基化却下降了(Figure 3 B)。iPS-MEF4 和 iPS-MEF10细胞对碱性磷酸酶和SSEA-1 (Figure 3 D)敏感，并表现出高端粒酶活性(Figure S2)。这些结果表明iPS-MEF4和iPS-MEF10与ES细胞相似，但并非完全相同。
在iPS-MEF3克隆，Ecat1, Esg1, 和 Sox2是失活的( Figure 3 A)。比起iPS-MEF4和 iPS-M
EF10克隆，Nanog在iPS-MEF3克隆中维持在较低水平。Oct3/4在iPS-MEF3-3, -5, and -6中被轻度激活，但在其他克隆中没有任何活性。与之对比的是，E-Ras和Fgf4在iPS-MEF3克隆中比起在iPS-MEF10 或 iPS-MEF4克隆中能被更高效率的激活。这些数据证实iPS-MEF3与iPS-MEF10和 iPS-MEF4超临界状态实质上是不同类型的
我们运用DNA microarrays比较了全球所有有关EScells, iPS cells, 和Fbx15βgeo/β geoMEFs基因表达的情况(Figure4A)。此外，我们还检查了转导了四个因子但没有经过G418选择的Fbx15βgeo/β geoMEFs，表达K-RasV12的癌化的MEFs，和用H-RasV12转化的NIH 3T3 cells。皮尔森相关分析（Pearsoncorrelation analysis）揭示iPS cells与ES cell较接近，但与fibroblasts和它们的derivatives相背离(Figure 4A)。The microarray analyses鉴定了在ES cells 和 iPS cells中普遍上调的基因，包括Myb , Kit, Gdf3, and Zic3 (group I, Figure 4 B and Table S3)。其他基因在ES cells, iPS-MEF4,和 iPS-MEF10比在iPS-MEF3中上调的更明显，包括Dppa3, Dppa4 , Dppa5 , Nanog , Sox2,Esrrb,和 Rex1 (group II)。上述这些基因的低表达可能是导致iPS-MEF3细胞多能性不同的原因。此外，我们发现了些在ES细胞中比在iPS细胞中更显著上调的基因，包括Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l, Utf1 , Tcl1, and the LIF receptor gene(group III)。这些数据证实：iPS细胞类似于，
但不完全等同于ES梁挠度>欧债危机论文细胞。
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