仅供生命科学研究使用。
不可用于诊断程序。
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent
货号：04 476 093 0011ml
货号：04 476 115 0015×1ml （2000次转染反应）
保存温度：+2至+8℃
1.产品用途
实验次数
按照标准程序，1 ml X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent用于HeLa, NIH 3T3,HEK-293等细胞的转染，在24孔板中的转染反应可至少进行400次；96孔板的转染反应，可至少进行1600次。
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent是一种脂质与其他组份
构成的混合液，经0.2μm膜过滤，装载于聚丙烯材质的管中。不含任何人源或动物来源组份。
保存与稳定性
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent于+2至+8°C条件下密闭保存，试剂可保持稳定性达标签注明的失效日期。
请勿冻存X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，每次使用试剂前漩涡1s或倒置混合均匀。
所需的其他设备与试剂
使用X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent进行转染所需的其他试剂与设备包括：
●将灭菌的无血清培养基（SFM）预热，培养基中勿添加其他 附加成分和补充因子。建议使用Opti-MEM I培养基稀释
siRNA和X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent.
●预转染的哺乳动物细胞系。
●siRNA溶液，浓度在0.2μg/μl（15pmoles/μl,[15μM]）至2μg/μl
（150pmoles/μl,[150μM]）之间。
应用
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent是一种多组分的高性能转染试剂，可以与siRNA形成复合物并高效输送至动物细胞。
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent的特性如下：
●该试剂被设计用于广泛细胞系的转染，包括HeLa，NIH 3T3，
HEK-293，PC-3，COS-7等。
●单一试剂可同时用于siRNA-或siRNA/质粒的共转染实验。●细胞毒性低，转染后不需要更换培养基。
●在有无血清的转染条件下，保持同等高效的转染性能，转染
前后均无需更换培养基。2. 如何使用本产品
2.1 实验开始前
siRNA纯度，荧光标记的siRNA
通过OD260nm/OD280nm的比值测定评估siRNA的纯度，转染实验用的siRNA纯度比值应>1.9。
如果前期通过体外转录反应制备siRNA，需控制siRNA长度在30bp 以内。成熟的动物细胞对长片段的siRNA会呈现一种干扰素应答，导致翻译过程受阻。Kim et al [1] 曾报道，必须去除体外转录siRNA 的5´端的三磷酸残基，以防干扰素应答。通常生物技术服务商合成的siRNAs 纯度和质量是适用于转染实验的。
细胞培养条件
为最小化实验内及实验间的转染效率差异，使用定期传代、增殖情况良好的处于对数生长期的细胞，始终使用一致的细胞密度进行接种。
培养基和其他培养添加物（血清等）
①对于某些细胞类型，细胞培养基中通常添加有抗微生物制剂（例如：抗生素与抗真菌制剂），这些添加物会降低X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent的转染效率。如可能，在初始实验中去除这些添加物。建立高效转染条件后，可重新进行添加，但同时需监测转染效率。
②培养基类型和成分（如血清质量）会影响到细胞生长与/或转染效率，以及靶基因的沉默效率。建议尝试不同的培养基，优化其中的组分，观察其对转染效率的影响。
转染时可以使用各种适合的培养基。但对于siRNA和
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent的稀释，建议使用
Opti-MEM I培养基。
③siRNA和X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent形成的转染复合物不会对转染后的细胞造成明显毒性，因此转染后无需更换培养基。但是对于长期培养来说，需要定期更换新鲜培养基以维持细胞良好的生长条件。特别是对于一些稳定表达蛋白的基因沉默研究，需要3-7天的转染后培养周期，以获得最大的沉默效率，必须定期更换新鲜培养基。
转染效率评估
基因沉默效率取决于研究使用的细胞系和研究的基因，对于实验室使用的新的细胞系，建议转染后评估转染效率。例如通过人内源性管家基因HPRT的qPCR检测基因沉默效率；或通过Western Blot 检测内源性基因lamin A/C的表达情况，确定沉默效率。
培养时间
转染后细胞培养时间一般在24-72h。具体的培养时间需根据siRNA、转染细胞类型、mRNA和目标蛋白的稳定性来决定。培养后通过合适的分析方法检测基因沉默效率。
2.2 实验流程
转染用细胞制备
转染前一天消化细胞、调整细胞浓度后接种细胞于合适的培养容器中。对多数细胞类型，24孔板中每孔加入0.45ml培养基，接种0.1-0.8×105个细胞，过夜培养后可达到30-50%的汇集度。对于其他规格的培养容器，请根据表1调整培养基体积，及siRNA和转染试剂的用量。
转染复合物比例
初期优化时建议制备3种不同浓度比例的转染复合物。
24孔板中细胞转染，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent:siRNA的复合物制备
为优化转染复合物比例，进行X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent（μl）与siRNA（μg）比值为10:2、2.5:0.5、1:0.2的3种不同比例试验。研究结果显示，这3种比例范围适用于各种常用的贴壁细胞转染，能获得高效基因沉默。
使用不含血清的培养基稀释X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent和siRNA复合物。
使用不含血清和抗生素的培养基稀释X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent（建议使用Opti-MEM I 培养基）。
首先在管中加入无血清培养基。试剂加入的先后顺序对实验结果十分关键。
●标记3个无菌小管：10，2.5，1。在第1管中加入40μl
无血清培养基，第2和3管中分别加入47.5μl和49μl
无血清培养基。
荔枝叶瘿蚊
●将X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent（分别取
10μl、2.5μl、1μl加至相应标记的管中）直接添加至培
养基中，切勿接触到塑料管壁。用头小心混匀。
（μl）μl）
10 40
10
2.5
47.5 2.5
1 49
1
勿振荡混匀。
为保证转染效率，避免将未稀释的X-tremeGENE siRNA
Transfection Reagent直接接触到塑料材质表面，如含培养基
的试管壁。转染试剂稀释后的5分钟内必须加入siRNA（见
）。
使用不含血清和抗生素的培养基稀释siRNA（建议使用
Opti-MEM I 培养基）。
首先在管中加入无血清培养基。试剂加入的先后顺序对
实验结果十分关键。
●标记3个无菌小管：50+2，50+0.5，50+0.2。按下表加
入无血清培养至终体积50μl。
（μl）μg) μl）
50+2 50+2
(150 pmoles)
50
50+0.5 50+0.5
(40 pmoles)
50
50+0.2 50+0.2
(15pmoles)
50
●将siRNA（分别取2μg、0.5μg、0.2μg加至标记的管中）
直接添加至培养基中，切勿接触到塑料管壁。用头小
心混匀。
勿振荡混匀。
为保证转染效率，避免将未稀释的siRNA直接接触到塑料
材质表面，如含培养基的试管壁。siRNA稀释后的5分钟内必
须与稀释的转染试剂混合（见）。
转染复合物的混合和孵育。
●将步骤1和2中稀释的转染试剂和siRNA按标签混匀。
-标记
10的稀释转染试剂与50+2混匀
-标记2.5的稀释转染试剂与50+0.5混匀
-标记1的稀释转染试剂与50+0.2混匀
●用头小心混匀。
勿振荡混匀。
●将转染试剂：siRNA复合物孵育在+15至+25℃下15-20
min。
●将每管内的复合物全部加至24孔板的孔内（1管对应1
孔）。
将复合物加至细胞。
●从培养箱中取出细胞培养板。无需弃去生长培养基。
●将转染复合物逐滴加至细胞中。轻柔振荡或旋转培养
板或培养瓶，确保培养物均匀分布于培养板表面。对
于
96孔板，建议使用旋转仪低速旋转30秒混匀。北京铁路医院
将培养板放回培养箱继续培养，直至基因沉默结果分析。
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent：siRNA复合物添
加至细胞中后，无需更换新鲜培养基（其他转染试剂可能需
要更换成新鲜培养基）。
对大部分细胞系的转染，如HeLa，NIH 3T3，HEK-293，
COS-7等，在含转染复合物的培养基中生长24-72小时，不
会影响基因沉默结果。如步骤中细胞在无血清培养基中进
行转染，可在转染复合物添加3-8h后更换为含血清培养基。
Reagent, siRNA和质粒DNA的用量优化
不同培养容器中转染条件的建立参见表1。X-tremeGENE siRNA
Transfection Reagent：siRNA的建议比例为5：1，实验初期建议
在此比例基础上进行转染试剂和siRNA用量的优化。
如需调整比例范围，可在X-tremeGENE siRNA Transfection
Reagent：siRNA的2-10：1的范围内进行进一步的优化。
表面积（cm）0.4 1.9 9
细胞接种量[×105]
建议起始量
0.05-0.2
0.1
0.1-0.8
0.4
1-4
2
培养基体积（ml）0.15 0.45 2.0
siRNA用量（μg）
建议起始量（μg）
稀释体积（μl）
0.05-0.3
0.15
15
0.1-1.0
0.5（40pmoles）
50
0.4-5.0
2.0
100
转染试剂用量（μl）
建议起始量（μl）
稀释体积（μl）
0.1-4.0
0.8
15
0.5-10
2.5
50
2-35
10
100
总体积（ml）0.18 0.55 2.2
表1
共转染实验
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent可用于siRNA和质粒
DNA的共转染。通常情况下，转染质粒DNA需要的细胞数量要多
于转染siRNA需要的细胞数量。对于应用X-tremeGENE siRNA
Reagent的共转染实验，请参考以下建议：
•提前接种细胞，使细胞在转染时的汇合度达到90%。
•如果您已优化siRNA转染的复合物比例，在进行共转时维持
同样的转染试剂：总核酸比例。(根据共转时增加的核酸总量[µg],
以相应的比例增加转染试剂的用量)。
•不同培养容器中共转染条件的建立和优化参见表2。
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent : 总核酸的用量比
例应至少大于3。
表面积（cm）0.4 1.9 9
细胞接种量[×105]
建议起始量
0.05-0.2
东方卫报
0.1
0.1-0.8
0.4
1-4
2
培养基体积（ml）0.15 0.45 2.0
siRNA用量（μg）
建议起始量（μg）
0.05-0.3
0.08
0.1-1.0
0.25
0.4-5.0
1.0
DNA用量（μg）0.15 0.5 2.0
稀释体积（μl）15 50 100
转染试剂用量（μl）
建议起始量（μl）
稀释体积（μl）
0.1-4.0
0.8
15
0.5-10
2.5
50
2-35
10
100
总体积（ml）0.18 0.55 2.2
表2
3疑难解答
基因沉默
水平低
转染效率低
转染时细胞密度不对于大多数细胞类型来说，在
多，或使用了静息
trs
期的细胞
数期定期传代的细胞
siRNA用量不足优化（增加）siRNA用量。
转染试剂用量不足针对各细胞系，均需优化转染
试剂和siRNA用量，及细胞培
养物中转染复合物的加入量。
转染时加入抗生素转染培养基中勿使用抗生素。
转染复合物形成不
佳
使用无血清培养基稀释转染试
剂和siRNA。
siRNA活性不佳
靶序列不合适选择其他的靶序列区域
d-siRNA降解通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
序列完整性。
勿将siRNA溶解在水中保存。
太仓市实验小学
将siRNA溶于灭菌的无RNase
缓冲液（10mM Tris,pH8.0,
20mM NaCl,1mM EDTA）
将siRNA分装保存在-15至
-25℃，避免反复冻融。
细胞数量过高，或
目标蛋白/mRNA
稳定性高
通过实验分析延长转染后细胞
培养的时间，对基因沉默水平
的影响，到最佳分析时间
通过qPCR分析mRNA水平
对于稳定蛋白的沉默实验，可
戏剧文学重复加入转染复合物，并定时
毒性Transfection Reagent的用量。
细胞对转染过程过
于敏感
转染后4-6小时，更换新鲜预热
的含血清培养基。该操作不会
影响转染效率。
转染中使用的
d-siRNA纯度不高
为避免翻译阻断和细胞凋亡的
激发，使用核苷酸链长度小于
30的高纯度siRNA [7]。
观察到基因沉默的脱靶效应靶序列的siRNA正
义链或反义链与其
他基因有很强的同
源性
选择其他的靶序列区域
降低siRNA浓度
将d-siRNA对应的靶序列长度
限制在<1.0kb
参考文献
1.Kim, D-H et al (2004) Nat. Biotech.22,321-325.
2.Bernstein, E. et al (2001) Nature 409,363-366.
3.Hammond, S.M. et al (2000) Nature 404,293-296.
4.Bass, B.L. (2001) Nature 411,428-429.
5.Hannon, G.J (2002) Nature 418,244-251.
6.Kaufmann, R.J. (1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,11693-11695.
7.Stark, G.R. et al (1998) Annu.Rev.Biochem 67,227-264.
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