通过核酸和磷酸钙以共沉淀物颗粒形式出现时，形成磷酸钙-dna沉淀物，使之黏附到培养细胞表面，利于细胞吞入、摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞。而进入细胞的dna仅有1％～5％可进入细胞核内，其中仅有不到1％的dna可以与细胞dna整合，在细胞中进行稳定表达。影响磷酸钙转染法转染效率的主要因素是沉淀中dna的量，沉淀停留在细胞上的时间长短，以及是否用甘油或二甲基亚砜(dmso）冲击，及冲击时间的长短。总的来说，磷酸钙转染中要用较高浓度的dna(1～50ng)。用磷酸钙介导的转染中，沉淀中dna的总浓度对于dna的摄取效率有极大的影响。对于某些细胞系，当在l0cm平皿中加入的dna多于10～15 ug时，就会导致细胞过多死亡以及很少的dna摄入。但对于其他细胞类型，如原代细胞，沉淀中需要有高浓度的dna，才能使dna进入细胞。 dna一磷酸钙沉淀在细胞上停留的最适时间随细胞类型不同而有所差别。此外甘油或二甲基亚砜冲击可极大地提高某些细胞类型的转染效率。本节主要介绍两种磷酸钙转染方法：
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【材料】
数据组织
1.2 x hepes缓冲盐溶液（hebs)280mmol/l nacl,10mmol/l kci,l.5mmo1/l na2 hpo4·2h20,12mmol/l葡萄糖、50mmol/l hepes。
将1.63g nacl,0.074gkc1,0.027g na数理化学习2hpo4·2h20,0.2g葡萄糖，1.19g hepes溶解于90ml双蒸水，用0.5mmo1/l nahc03调ph为7.1，然后用蒸馏水定容l00ml。检测转化效率，用0.22 um的硝酸纤维素膜过滤除菌，分装，-20℃保存。
2. 2 x bes缓冲液（bbs) 50mmol/l n,n-双（2-羟乙基）2-氨基乙磺酸（bes),280mmo1/l nacl,l.5mmo1/l na2hpo4(ph 6.95）。
将1.07g bes,1.6g nacl,0.027g na2hpo4·2h20溶于总体积90ml的双蒸水中。在室温下用hcl将溶液的ph调至6.96，然后用双蒸水将体积调至l00ml。用0.22 um的硝酸纤维素膜过滤除菌，贮存于-20℃（可以反复冻融）。
3. 2mo1/l cacl2将10.8g cacl2·6h20溶于20ml双蒸水，用0.22um的硝酸纤维素膜过滤除菌，按每小瓶1 ml分装，冻存于-20℃。
4. telmmol/l tris-hc1,0.lmmol/l edta(ph 8.0）。
5. dna溶液将需要转染的dna用乙醇沉淀（10～50ug/cm平板），空气中晾干。将沉淀dna重悬于te液中（浓度为0.5～1.0ug/ml) 0 4℃保存。
6. 0.1 mol/l pbsnacl 8g, kcl 0.2g, na2hpo4·12 h20 1.44g,kh2p04 0.4g加水至l000ml，用0.22 um或0.45 um的硝酸纤维素膜过滤除菌，4℃保存备用。
7. g418（新霉素g418）液 将1g g418溶于1 mmol/l hepes缓冲液中，加双蒸水10ml，过滤除菌，4℃保存备用。
8. g418选择性培养基用含10％胎牛血清的dmem培养基配制，g418的浓度为200～800mg/l。 9．其他试剂0.25%胰蛋白酶等。
【方法】
1．利用hepes缓冲溶液系统的磷酸钙转染法将hepes缓冲盐溶液与含有氯化钙及dna的溶液缓慢混合，可形成含磷酸钙和dna的沉淀，然后直接吸附于细胞的表面，通过不明机制将外源dna导入细胞内。
(1)供体dna制备：将需要转染的dna用乙醇沉淀，空气中晾干，然后将沉淀dna溶于te中（浓度为40mg/l)。4℃保存。
(2）受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠balb/c3t3或nih3t3细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向。细胞一般于转染前24小时传代，吸去旧培养基，加2～3 ml 0.25%胰蛋白酶于室温下消化3～5小时。当在显微镜下观察细胞皱缩变圆时，吸去消化液，加入含10％胎牛血清的dmem完全培养基，用吸管轻轻吹打细胞，使细胞悬浮后接种，接种密度为2x104个／cm2，置37℃ ,5% c02孵箱培养，待细胞生长达50％～75％瓶底面积时即可进行转染。
(3) dna-磷酸钙沉淀物的制备
1)将供体细胞dna和psv2-neo质粒dna用te配制成40mg/l的dna溶液，同时向供体细胞dna溶液200ul中加入带新霉素基因的质粒dna溶液（20mg/l) 220ul和 2xhepes液250u1(psv2-neo为1～2mg/l)；
2）取500 u1上述dna溶液加入硅化试管中，在振动下缓慢加入3.lml 2mol/l cacl2（约需30秒加完）,充分混匀。
3)然后立即混旋，室温下静置试管，约5分钟出现轻度混浊，浊度越来越浓，大约在20～30分钟时，出现细小颗粒，经吹打后即可进行转染受体细胞。
(4）转染受体细胞：待转染的受体细胞培养于25 ml培养瓶内。
1)在转染前4小时将处于对数生长期的受体细胞更换一次新鲜培养液，每瓶加培养液5 ml；
2)充分混匀dna-磷酸钙沉淀，取0.5m1加入待转化细胞的培养基中，轻轻地摇动，使其均匀；或除去培养瓶内的培养基，取0.5 ml dna沉淀液逐滴加到细胞表面，室温下静置20～30分钟，然后再加入5 ml完全培养基。此时培养液变为橘黄，置37℃,5% co2孵箱培养24小时或更长，使细胞充分吸入dna-磷酸钙结晶颗粒；
莎叶兰3)除去培养液，用5ml pbs洗细胞2次，更换5 ml完全培养液，继续培养细胞24小时，诱导转染基因的表达；
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4）稳定转化克隆的筛选：更换浓度为800mg/l的g418选择性培养基进行筛选。同时要设置未能转染的对照组细胞；
5)培养需要3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/l的g418选择性培养基，每3～4天更换一次选择性培养基；燃烧海洋上的海盗
6)2周后，对照细胞死亡，转染细胞瓶中出现耐药细胞克隆，即长出岛状细胞克隆。在它被放大后，它将被克隆和扩大用于培养，以便建立转化的细胞系和进一步鉴定。
(5）在显微镜下选出生长状态良好的细胞克隆。将旧培养基弃去，加胰蛋白酶消化液消化5分钟（消化时间视其细胞的不同有所变化），吸去消化液。用吸管首先吸少许培养基，对准欲挑选的细胞克隆，轻轻吹吸3～5次，将其转入24孔板内，如此反复2～3次，尽量将细胞克隆的所有细胞都吸出。待孔底长满细胞后，转入较大的培养瓶内扩大培养。当细胞长至足够量（107～108）时即可进行dna,rna的杂交分析和表达蛋白质的检测。
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