携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 拓扑关系赵金匣;王志平;陶燕;贺振华;郭琦;洪梅
【摘 要】Objective To construct an eukaryotic expression vector of human B-cell translocation gene 2 (BTG2), to express the FLAG-tagged BTG2 protein in HeLa cells,and to supply an experimental tool for investigating the function of BTG2 gene.Methods The full-length BTG2 fragment was obtained by PCR and inserted into the multiple cloning site of pcDNA3.1 (+)vector. Oligo DNA encoding FLAG tag was designed and inserted into pcDNA3.1(+)-BTG2 to construct another vector pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2.The HeLa cells were divided into pcDNA3.1(+)empty vector group,pcDNA3.1(+)-BTG2 group and pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2 group.The HeLa cells were transfected with recombinant plasmids.Western blotting using anti-FLAG antibody was performed to detect the expression of FLAG-BTG2 protein in HeLa cells.Results The sequence of the vector was verified by both BamH Ⅰ endonuclese digestion and DNA sequencing. The Western blotting analysis confirmed that FLAG-fused BTG2 was detected in pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2 grou
p but not in empty vector or pcDNA3.1(+)-BTG2 groups. Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2 is successfully constructed and FLAG-tagged BTG2 protein is expressed in HeLa cells.%目的：构建人 B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体，并在 H eLa细胞中表达携带 FLAG标签的BTG2蛋白，为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用 PCR法获得全长 BTG2片段，将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体 pcDNA3.1（＋）的多克隆位点；然后按照 FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段，插入 pcDNA3.1（＋）-BTG2载体，构建 pcDNA3.1（＋）-FLAG-BTG2载体；将以上重组质粒转染 HeLa细胞，将细胞分为转染 pcDNA3.1（＋）空载体组、转染 pcDNA3.1（＋）-BTG2组和转染 pcDNA3.1（＋）-FLAG-BTG2组，采用抗 FLAG抗体的 Western blotting法，检测 FLAG-BTG2融合蛋白在 HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于 pcDNA3.1（＋）质粒，经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及 DNA测序证实载体序列准确；该载体转染 HeLa细胞后用抗 FLAG 抗体进行 Western blotting 法检测，在空载体组和 pcDNA3.1（＋）-BTG2组 HeLa细胞中检测不到 FLAG 融合蛋白的表达，而在转染 pcDNA3.1（＋）-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了 pcDNA3.1（＋）-FLAG-BTG2真核表达载体，并能在 HeLa细胞中有效表达携带 FLAG标签的BTG2蛋白。 【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2014(000)006
汤爱民教授【总页数】6页(P1149-1154)
【关键词】B细胞易位基因 2;抑癌基因;FLAG标签;真核表达载体;融合蛋白
【作 者】赵金匣;王志平;陶燕;贺振华;郭琦;洪梅
【作者单位】兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，甘肃 兰州 730030;兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，甘肃 兰州 730030;兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，甘肃 兰州 730030;兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，甘肃 兰州 730030;兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，甘肃 兰州 730030;兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室甘肃省泌尿
系统疾病临床医学中心，甘肃 兰州 730030
【正文语种】中 文
【中图分类】网路管理Q291
吕文彦
BTG2Pc3／Tis21是一个新发现的抗增殖基因，属于BTG／TOB基因家族，实验室和临床研究［1］均表明BTG2可能是一个抑癌基因。BTG2在细胞周期调控、细胞生长与分化和DNA损伤修复等方面发挥着重要功能，该基因已被证实对多种肿瘤的发生和发展具有抑制作用［2－4］。最初 BTG2Pc3／Tis21基因是在大鼠Pc12嗜铬细胞瘤株cDNA文库中被发现的，Pc3是可被神经生长因子（nerve growth factor，NGF）特异诱导的具有抗增殖活性的蛋白。随后，Fletcher等在小鼠NIH3T3细胞中发现了相似的序列并将其命名为Tis21，Tis21能被肿瘤促进剂佛波酯（12－O－tetradecanoylphorbol－13－acetate，TPA）诱导，属早期应答基因［5］。人BTG2基因最早是由Rouault等在寻p53的靶基因时发现并克隆成功的，人BTG2基因位于人类染体1q32区，编码一个含有158个氨基酸的蛋白，蛋白N端含有一个高度保守的APRO功能结构域［6］。BTG2高表达于肾近端小管、肺泡支气管上皮细胞和前列腺腺泡的基底细胞层［7］。研究［8］证明BTG2能被抑癌基因p53诱
导而发生转录激活，并进一步参与细胞周期调控和DNA损伤应答。BTG2还能抑制细胞周期蛋白cyclin D1的转录，通过诱导G1期阻滞抑制细胞周期进展。目前的研究提示：BTG2发挥抗肿瘤作用的分子机制，主要是通过转录调控和mRNA降解途径影响一系列肿瘤相关基因的表达，另外还可能通过蛋白质相互结合发挥作用，然而其具体的作用机制并不十分清楚。BTG2是一个新近发现的蛋白，能够从生物公司购买到的抗体虽有不少种，但这些抗体的灵敏度和特异性都非常有限，应用效果欠佳。在缺乏有效抗体的情况下，为开展蛋白质功能研究，本课题组在BTG2的N端插入了一个FLAG标签。FLAG是由8个氨基酸（NAsp－Tyr－Lys－Asp－Asp－Asp－Asp－Lys－C）组 成 的 亲水性短肽，可标记于重组蛋白质的N端、C端或中心。FLAG标签具有抗原性，能被抗FLAG抗体识别，因此带FLAG标签的目标蛋白就可通过Western blotting法和免疫荧光技术等方法进行方便的检测。由于FLAG标签很小，通常对目标蛋白的立体结构和生物活性不会产生影响，可帮助分析靶蛋白的生物学功能［9］。本实验利用蛋白标签的优点，在 pcDNA3.1（＋）－BTG2质粒中插入了FLAG标签，将质粒导入HeLa细胞系中，用标签抗体检测到了目标蛋白的表达，为进一步研究BTG2蛋白的功能奠定实验基础。 1 材料与方法
1.1 细胞、主要试剂和仪器 HeLa细胞复苏自本研究所冻存细胞，培养基和血清购自美国Hyclone公司。pcDNA3.1（＋）质粒购自美国Invitrogen公司，pSG5－BTG2质粒由意大利Perugia大学Francesco Grignani教授惠赠。DH5α感受态细胞、DNA Marker、氨苄青霉素和质粒提取试剂盒购自天根公司，Prime STAR HS DNA聚合酶、T4DNA连接酶和限制性核酸内切酶购自宝生物公司，引物合成及DNA测序由上海生物工程有限公司完成。Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，蛋白Marker购自美国NEB公司，单克隆 ANTI－FLAG M2抗体购自美国Sigma公司。Odyssey封闭液和IRDye 800CW偶联的羊抗鼠二抗购自北京北方仪涛商贸有限公司。DNA电泳槽和电泳仪为北京六一仪器公司产品，PCR仪、Western blotting所使用的电泳槽和半干转印槽为美国Bio－Rad公司产品，Odyssey近红外激光扫描成像仪为美国Li－Cor公司产品。
1.2 pcDNA3.1（＋）－BTG2载体的构建及鉴定由于pSG5载体表达效率比较低，而且没有可供稳定转染使用的新霉素抗性基因，所以本研究以pSG5－BTG2质粒为模板，用PCR方法扩增出BTG2全长编码序列，重新插入pcDNA3.1（＋）载体的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间。根据BTG2 mRNA序列（NM＿006763.2）的编码区设计PCR引物，在上游引物中插入EcoRⅠ酶切位点（GAATTC）和 Kozak翻译起始序列（GCCACC），在下游引物中插入
XhoⅠ酶切位点（CTCGAG）。引物序列如下，BTG2－F：5′－ATAGAATTCGCCACCATGAGCCACGGGAAGGGAAC－3′，BTG2－R：5′－ATACTCGAGCTAGCTGGAGACTGCCATCACGTAG－3′。以pSG5－BTG2质粒为模板，用高保真Prime STAR HS DNA聚合酶进行PCR，PCR 反 应 条 件 为：98℃、10s，55℃、15s，72℃、1min，30个循环。经琼脂糖凝胶电泳验证目的条带后，用PCR产物纯化试剂盒回收BTG2目的片段。用EcoRⅠ和XhoⅠ分别双酶切pcDNA3.1（＋）质粒和PCR产物，用T4DNA连接酶连接载体和插入片段。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，从LA培养板挑取6个单克隆，于100μL LA培养基中培养2h，取1μL菌液在25μL体系中进行PCR鉴定，所用引物同上，选择PCR阳性的菌种送公司测序。
回看天际下中流
1.3 在pcDNA3.1（＋）－BTG2载体中插入 FLAG标签 设计Oligo DNA：根据FLAG的氨基酸序列设计2条互补的Oligo DNA，合成PAGE纯化级DNA，2条链退火后插入pcDNA3.1（＋）－BTG2载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间。Oligo DNA序列如下，FLAG－top：5′－GATCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG －3′，FLAG－bottom：5′－AATTCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGC－3′。FLAG－top 包 含1个5′－BamHⅠ 酶 切 位 点 的 突 出 末 端 （5′－GATC）、Kozak翻译起始序列（GCCACC）
、起始密码子（ATG）和 FLAG 编 码 序 列 （GACTACAAGGACGACGATGACAAG），FLAG－bottom 包 含1个5′－EcoRⅠ酶切位点的突出末端（5′－AATTC）。将 pcDNA3.1（＋ ）－BTG2 载 体 用 BamH Ⅰ 和EcoRⅠ双酶切，退火后的Oligo DNA其突出的黏性末端可连接于酶切后的载体。Oligo DNA的退火和连接：将2条互补Oligo DNA进行退火，先用TE溶解Oligo DNA至浓度为100μmol·L－1，然后将FLAG－top与FLAG－bottom溶液按1∶1混合（浓度为50μmol·L－1），退火条件为：95℃、30s，72℃、2min，37℃、2min，25℃、2min，冰上储存。连接之前先用TE 1∶100稀释退火Oligo至0.5μmol·L－1，连接反应体系如下：酶切载体 （25mg·L－1）2μL，退火 Oligo DNA（0.5μmol·L－1） 1 μL， BSA （10g·L－1）0.5μL，10× T4DNA 连接酶缓冲液1.5μL，T4DNA连接酶（400U·μL－1）0.5μL，无核酸酶水9.5μL，室温连接3h，但不要长于3h，转化前－20℃储存。4μL连接产物转化100μL感受态大肠杆菌DH5α后，在含氨苄青霉素的平板中筛选挑取菌落后抽提质粒。构建的载体用BamHⅠ酶切鉴定，酶切鉴定正确后进行DNA序列测定。
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