天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University 第26卷6期
广丰县教育局2020年11月521新知
Vol. 26, No. 6
Nov. 2020文章编号 1006-8147(2020)06-0521-05
重组质粒pcDNA4-FLAG-GLUTl 构建及蛋白表达 论著徐子豪，史小雨，王倩
(天津医科大学基础医学院免疫学系，天津300070)
摘要 目的：为探究葡萄糖转运蛋白l(GLUTl )磷酸化水平对红细胞期疟原虫生长发育的影响，构建必要的分子工具。方法：以 pcDNA TM 4/TO/myc-His B 为载体，构建在GLUT1第一个胞外区插入2x FLAG 标签的重组质粒pcDNA4-2x FLAG-GLUT1。将重组 质粒转染到NIH/3T3细胞中，利用Western 印迹和流式细胞术分别检测细胞FLAG-GLUT1蛋白总量和细胞表面FLAG-GLUT1 的表达水平。结果：酶切鉴定及DNA 测序表明正确构建重组质粒pcDNA4-2x FLAG-GLUT1j 通过识别FLAG 标签，利用 Western 印迹能够检测到FLAG-GLUT1在NIH/3T3细胞中的表达，流式细胞术结果显示，转染重组质粒的细胞表面可检 测到 FLAG-GLUT1的表达，阳性比例为(21.46 土 2.375)%，明显高于对照组(0.01±0.00)%，差异有统计学意义+二9.035 ,"<0.01 J 结论：成功构建重组质粒pcDNA4-2x FLAG-GLUT1，为研究GLUT1蛋白磷酸化在疟原虫感染红细胞中的作用提供了必要的工具。 关键词 葡萄糖转运蛋白1；蛋白磷酸化；恶性疟原虫
中图分类号R382.31 文献标志码 A
Construction of recombinant plasmid pcDNA4-FLAG-GLUT 1 and protein expression木马杀客
XU Zi-hao, SHI Xiao-yu, WANG Qian
(Department of Immunology , School of Basic Medical Sciences , Tianjin Medical University /Tianjin 300070, China)Abstract Objective ： To study the effect of glucose transporter 1(GLUT1) phosphorylation on the growth of blood-stage Plasmodium , and construct a necessary molecular tool. Methods ：Using pcDNA™ 4/TO/myc-His B as a vector,the recombinant plasmid pcDNA4-2x FLAG- GLUT1 was constructed by inserting 2x FLAG tag into the first extracellular domain of GLUT1.The recombinant plasmid was transfected into NIH/3T3 cells.The total amount of FLAG-GLUT& protein and the level of FLAG-GLUT& on the cell surface were detected by Western blotting and flow cytometry , respectively. Results ： Th
e results of restriction enzyme digestion and DNA sequencing showed that the recombinant plasmid pcDNA4-2x FLAG-GLUT1 was constructed correctly. By recognizing the FLAG tag, the expression of FLAG-GLUT1 in NIH/3T3 cells could be detected by Western blotting. The results of flow cytometry showed that the expression of FLAG-GLUT1 was detected on the cell surface transfected with recombinant plasmid ,and the proportion of positive group was (21.46 ± 2.375)%,which was significantly higher than that of control group (0.01 ± 0.00)%(£ = 9.035,+ < 0.01 ). Conclusion : The recombinant plasmid pcDNA4-2x FLAG-GLUT& is successfully constructes which provides a necessary tool for studying the role of GLUT& phosphorylation in Plas modium-infected red blood cells.
hecKey words glucose transporter 1; protein phosphorylation ; Plas mo d i u m f alc ip a rum,
疟疾是由疟原虫(plasmodium )感染所引起的寄 生虫疾病，通过雌性按蚊叮咬人体传播，在全球范 围内仍有着较高的发病率和死亡率[1]o 疟原虫在人
体的寄生生活主要分为肝细胞期和红细胞期，其中 以红细胞期引起的临床症状最为明显倒。红细胞期 疟原虫的能量来源主要依靠摄取宿主血液中的葡
萄糖进行糖酵解电葡萄糖依次通过红细胞膜表面葡萄 糖转运蛋白(GLUT))、包绕疟原虫的纳虫泡膜(pa
ra - sitophorous vacuole membrane , P VM )和疟原虫质膜上 的己糖转运蛋白(hexose transporter ,HT )，最终进入
疟原虫体内％由于无氧糖酵解产生ATP 效率低下, 疟原虫需要摄取大量葡萄糖以维持正常生长c5d 。基金项目天津市教委科研计划项目(2018KJ085)
作者简介徐子豪((996-),+ ，硕士在读，研究方向：免疫学；通信作 者：王倩，E-—ail:wa n gq @tmu.edu.c GLUT1在人体内广泛存在，是红细胞和血-脑屏 障中最主要的GLUT o 有研究报道，对正常红细胞和
广东工业大学学报感染恶性疟原虫(Plas modium falc i p arum , P. falc i - parum )的红细胞进行磷酸化蛋白质组学分析，发现
感染红细胞表面GLUT1的磷酸化状态发生改变叫
在伯式疟原虫(Plasmodium berghei ,P. berghei )感染 的肝细胞阶段，肝细胞会上调细胞表面GLUT1的
表达量和转运效率以增加葡萄糖的摄取叫而在人
类遗传疾病GLUT1缺陷综合征中,GLUT1磷酸化吴元欣
状态的改变也会影响葡萄糖的正常吸收冋。可见， GLUT1的磷酸化水平对其在细胞表面的表达量及
葡萄糖转运效率至关重要。
GLUT1的磷酸化既可能引发胞浆内的GLUT1 囊泡转位到细胞膜，又可能调控细胞表面GLUT1的
葡萄糖转运效率。而红细胞缺乏囊泡转运机制，只能
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