一.DNA的提取方法简介
为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提
取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中，小牛胸腺?动物肝脏?鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠
肝菌含9%~10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大，一般
心有林希达2×10 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。
1、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白粉末或结晶，DNA则为白类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等 有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在
中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细 胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA
及无机离子等，从中分离DNA 。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，
比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶
解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
2.细胞的破碎
细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方
法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：
①破碎细胞难；从处死动物?分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎，即使是较 易破碎的肝?肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。
②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。
对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。
3.DNA提取的几种方法
(1).浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用
1M 氯纳提取化钠抽提，得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡，使乳
中国实验方剂学杂志
化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿---异醇法除去蛋白.
两种方法比较，后种方法使核酸降解可能少一些. 无水醋酸钠新闻
以稀盐酸溶液提取DNA 时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用，在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠，并称SSC溶液，提取DNA.
（2）.阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，因为阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA.
（3）.苯酚抽提法:水葫芦喊冤
苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 .
（ 4）.水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇，立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ?80%和95%乙醇以及丙铜洗涤，最后在空气中干燥，既得DNA样品.此法提取
的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良，在提取过程中加入SDS.
二，植物病毒的RNA提取：
大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。
一、材料
提纯TMV病毒液（10mg/ml）。考风考纪
二、设备
冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂
TE-饱和酚：氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液，无RNA酶的双菌水。
四、操作步骤
1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。
2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。
4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。
5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。
6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。
7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。
[注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。
2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。
动植物组织mRNA提取：
一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，
电泳仪，电泳槽。
三、试剂
1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，
然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然
后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。李商隐咏史
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris?Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，
西门子cx651mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris?Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，
0.05% SDS。无水醋酸钠新闻
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