1.某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。
2。说明Sanger DNA测序法的原理。
答：Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的
作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延
伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末
端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获 得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的
序列。
3．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 回文序列是：5'-CATATG-3，
4．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：
GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 为什么?
GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。
5．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?
为什么?
注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一
种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。
6．为什么反转录酶在聚合反应中会出错?
由于反转录酶缺少在E．coli DNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500个碱基中可能有一个错配。
7．什么是测序酶(sequenaseTM)?
答：
所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使T7 DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'---3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，测序时常用此酶。
8． 什么是S1核酸酶作图(S1 nuclease mapping)?
答：
S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法
9 YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越
性?
答：
YAC带有天然染体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。 10． 列举质粒载体必须具备的4个基本特性。
．答：
(1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。
11． 什么叫穿梭载体？
答：
含有细菌质粒和克
隆的真核生物DNA片段的质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。
12． 如何将野生型的l噬菌体改造成为一个理想的载体?
答：
(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记；
(4)引入终止突变
13．答：
13． PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?
(1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
14． cDNA克隆与基因组克隆有何不同?
．答：
基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子
15． 怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?
答：
化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。
16． 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。
答：
(1)COS位点可以自身环化； (2)可以利用COS位点包装l噬菌体颗粒；
(3)可以感染寄主细胞； (4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。
17． 酵母人工染体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?
答：
(1)着丝粒； (2)端粒； (3)ARS序列。
18． 何谓YAC? 主要特性是什么?
风流茶说合
答：
(1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染体，叫YAC；
(2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。
19． Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在
哪里?
答：
PCR用双引物，体内复制用单引物。
20．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应
注意哪些问题?
答：
应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌
21．假定你分离到一个E．coli的Thy- 突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计
一个方案用PCR从染体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E．coli
野生型的ThyA基因的序列是已知的)
答：
为了扩增突变体的thyA基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA基因的5’端相同，另一个引物同该基因的3’端互补。在引物的5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。
22． 你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据
方案，下面一步骤
是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，
直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自
显影片是空白。错在哪里?
答：
如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。
23．切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?
答：
(1)DNaseI造成切口；
包钢大集体改制(2)DNA聚合酶III的5’ ?3’外切核酸酶进行切割；
(3)DNA聚合酶Ⅲ的5’?3’合成酶进行修补；
(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中
24．用EcoRI和Hind Ⅲ分别切割同一来源的染体DNA，并进行克隆，在前者的克隆
中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。
答：
原因是：HindⅢ的切点在A基因内。
25．什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?公安派出所组织条例
答：
Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。
26．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，
并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基
酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用 DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets
受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。
答：
基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的
27．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA
而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?
答：
这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。
四、问答题：
1． 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
1． 答：
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。 基本原则： 3-4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母： 取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写；
(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。
第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小
写，根据原来的情况而定，
但用正体。 顺序号： 若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、… 等，用
正体。
2． 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影向?
答：
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限
制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松
动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因
经纬线条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星
活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性
内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0
以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如
Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。
3． 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?
答：
影响DNA连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链通常以12°C一15°C最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100倍。DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA连接酶的活性，但是，如果NaCl的浓度高于150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。
设备安装规范另外反应体系中有NH4+离子的存在，对E．coli DNA连接酶具有激活作用。E．coli DNA
连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4 DNA连接酶需要ATP。
4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?
答：
Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。
Klenow酶主要有下列用途：
(1)修复反应，制备平末端
可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。
用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而
修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。
(2) 标记DNA3'突出末端(protruding end)
该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标
记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。
(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链DNA探针等。
5．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?
答：
主要差别是：CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。应用：
(1)dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，再进行连接反应。
(2)DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。
测试446．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?
答：
外切核酸酶是从 噬菌体感染的E．coli中分离纯化的，能够从双链DNA上依次切下5'单核苷酸，作用底物是双链DNA的5'磷酸末端，不能切割羟基化5'端。该酶虽然能切割单链DNA，但效率较低(下降200倍)。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5'末端，以便让末端转移酶加尾。
7．Mn2+、Mg2+对Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影响?Dnase I在基因工程中有什么作用?
答：
DNase I是一种内切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I随机切割DNA两条链中的任意一条链；当Mn2+代替Mg2+时，DNase I几乎是在双链DNA两条链相对的位置上打开缺口，使双链DNA断裂，产生的末端几乎是平末端或只突出1～2个核苷酸的DNA片段。
DNase I有许多用途：(1)在切口移位标记中，制造切口；(2)在足迹法中保护DNA；
(3)除去RNA制备物中的DNA；(4)体外转录中除去DNA模板；(5)检测染体中的转录活性区；(6)产生可在噬菌体M13载体上进行测序的随机克隆。
8．质粒如何维持在细胞中的稳定？
质粒通过以下几种机制维持在细胞中的稳定：
(1)多聚体质粒的分解
如果质粒在复制时形成多聚体的话，在细胞分裂过程中质粒丢失的可能性就会增加。一个多聚体是由多个单体相互连接而成的。多聚体的形成可能是由于在复制终止时发生错误或者是由于单体间
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