⼀⽂读懂分⼦诊断技术、PCR技术、基因测序技术的区别、原理以及发展历 程！
分⼦诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，⽤分⼦⽣物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从⽽对⼈体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有⽆基因⽔平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分⼦⽣物学⽔平的⽅法学技术都属于分⼦诊断技术，⽐如PCR技术、基因测序技术等等。 PCR技术即聚合酶链式反应是⼀种⽤于放⼤扩增特定的DNA⽚段的分⼦⽣物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退⽕--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA与引物的退⽕(复性)，引物的延伸。重复循环变性--退⽕--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，⽽且这种新链⼜可成为下次循环的模板。每完成⼀个循环需2～4分钟，2～3⼩时就能将待扩⽬的基因扩增放⼤⼏百万倍。由1983年美国Mullis⾸先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞⽣。简单讲PCR技术本质上是针对DNA⽚段进⾏扩增放⼤，通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。 基因测序技术即测定DNA序列的技术。在分⼦⽣物学研究中，DNA的序列分析是进⼀步研究和改造⽬的
基因的基础。⽬前⽤于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终⽌法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这⼆种⽅法在原理上差异很⼤，但都是根据核苷酸在某⼀固定的点开始，随机在某⼀个特定的碱基处终⽌，产⽣A，T，C，G四组不同长度的⼀系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进⾏检测，从⽽获得DNA序列。⽬前Sanger测序法得到了⼴泛的应⽤。简单讲基因测序技术是针对DNA⽚段进⾏测序和分析，使得DNA序列得以清晰。
下⾯⼀起来了解⼀下分⼦诊断技术近50年的发展历程：
基于分⼦杂交的分⼦诊断技术
上世纪60年代⾄80年代是分⼦杂交技术发展最为迅猛的20年，由于当时尚⽆法对样本中靶基因进⾏⼈为扩增,⼈们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进⾏捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针⼈⼯合成的出现，为基于分⼦杂交的体外诊断⽅法进⾏了最初的技术储备。 (⼀)DNA印迹技术(Southern blot)
Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术，通过限制性内切酶将DNA⽚段化，再以凝胶电泳将长度不等的DNA⽚段进⾏分离，通过虹吸或电压转印⾄醋酸纤维膜上，再使膜上的DNA变性与核素标记的
寡核苷酸探针进⾏分⼦杂交，经洗脱后以放射⾃显影鉴别待测的DNA⽚段-探针间的同源序列。这⼀⽅法由于同时具备DNA⽚段酶切与分⼦探针杂交，保证了检测的特异性。因此,⼀经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分⼦检测⽅法,⼴为运⽤于各种基因突变，如缺失、插⼊、易位等，及与限制性酶切⽚段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的⾦标准。
维度打击
湖南同志(⼆)ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)
使⽤核酸印迹技术进⾏核酸序列的杂交检测具有极⾼的特异性，但存在操作极为繁琐，检测时间长的缺点。1980年建⽴的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进⾏样本固定的缺点。通过在质粒载体导⼊单碱基突变的⽅法，构建了⾸条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO)，更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]⾸次将PCR的⾼灵敏度与ASO斑点杂交的⾼特异性结合起来，实现了利⽤ASO探针对特定基因多态性进⾏分型。其后为了完成对同⼀样本的多个分⼦标记进⾏⾼通量检测,Saiki[4]⼜发明了ASO-RDB，通过将⽣物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显⾊，进⾏基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同⼀膜条上，只需通过1次杂交反应，即可筛查待检样本DNA的数⼗乃⾄数百种等位基因，具有操作简单、快速的特点,⼀度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常⽤的技术。
(三)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)
FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]⾸次使⽤荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代，细胞遗传学和⾮同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应⽤。相⽐于其它仅针对核酸序列进⾏检测的分⼦诊断技术,FISH结合了探针的⾼度特异性与组织学定位的优势，可检测定位完整细胞或经分离的染⾊体中特定的正常或异常DNA序列；由于使⽤⾼能量荧光素标记的DNA探针，可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。
如今,FISH已在染⾊体核型分析，基因扩增、基因重排、病原微⽣物鉴定等多⽅⾯中得到⼴泛应⽤。通过⽐较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍⽣技术，使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作⽤。
(四)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)
MLPA技术于2002年由Schouten等[6]⾸先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸⽚段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍⽣法制备；每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸⽚段都与靶序列进⾏杂交，再使⽤连接酶连接2部分探针。连接反应⾼度特异，只有当2个探针与靶序列完全杂交，连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有1个碱基的差别，就会导⾄杂交不完全，使连接反应⽆法进⾏。连
接反应完成后,⽤1对荧光标记的通⽤引物扩增连接好的探针，每个探针扩增产物的长度都是唯⼀的。最后，通过⽑细管电泳分离扩增产物，便可对把核酸序列进⾏检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进⾏鉴定。
该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的⾼通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分⼦诊断体系，是⽬前临床最为常⽤的⾼通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进⾏检测的⽅法。
(五)⽣物芯⽚
1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利⽤其所研发的光蚀刻技术制备了⾸个以玻⽚为载体的微阵列，标志着⽣物芯⽚正式成为可实际应⽤的分⼦⽣物学技术。时⾄今⽇，芯⽚技术已经得到了长⾜的发展，如果按结构对其进⾏分类，基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯⽚与基于微流控(microfluidic)的反应芯⽚2种。
1.微阵列芯⽚
(1)固相芯⽚：微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯⽚：将微阵
列技术应⽤于MGDP 检测中已有超过⼗年的历史，其技术平台主要分为2类，即微阵列⽐较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。顾名思义,aCGH芯⽚使⽤待测DNA与参⽐DNA的双⾊⽐对来显⽰两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,⽽单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯⽚则⽆需与参⽐DNA进⾏⽐较，直接通过杂交信号强度显⽰待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,⽬前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的⾼分辨率混合基因阵列芯⽚。MGDP芯⽚主要应⽤于发育迟缓、先天性异常畸形等⼉童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证，使⽤MGDP芯⽚进⾏染⾊体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8]，表达谱芯⽚(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]⾸次使⽤cDNA芯⽚绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发⽣发展中的作⽤⽇益得到重视,⽬前也已出现microRNA芯⽚、长链⾮编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯⽚等。类似于MGDP芯⽚,GEP芯⽚使⽤反转录后⽣成的cDNA⽂库与固定于芯⽚载体上的核酸探针进⾏杂交，从⽽检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交,GEP芯⽚对⽣物学意义更为重要的转录组信息进⾏检测，对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。⽬前使⽤GEP芯⽚对急性髓细胞⽩⾎病、⾻髓增⽣异常综合征等⾎液病及神经退⾏性变等进⾏诊断、分类及预后评估已经获得了令⼈满意的效果;
(2)液相芯⽚：传统固相芯⽚将检测探针锚定于固相载体上捕获⽬的序列,⽽Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同⽐例的2种红⾊荧光染料，将聚苯⼄烯微球标记为不同的荧光⾊，并对其进⾏编码
得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联⾄编码微球上，使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利⽤混合后的探针-微球复合物与待测样本进⾏杂交，使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双⾊流式细胞仪，其中红⾊激光检测微球编码，绿⾊荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,⼀次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。⽬前，该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及⼈乳头瘤病毒分型取得了⼴泛的应⽤。
2.微流控芯⽚
1992年Harrison等[11]⾸次提出了将⽑细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想，通过分析设备的微型化与集成化，完成传统分析实验室向芯⽚上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯⽚(microfluidic chip)由微⽶级流体的管道、反应器等元件构成，与宏观尺⼨的分析装置相⽐，其结构极⼤地增加了流体环境的⾯积/体积⽐，以最⼤限度利⽤液体与物体表⾯有关的包括层流效应、⽑细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能，从⽽在1张芯⽚上完成样品进样、预处理、分⼦⽣物学反应、检测等系列实验过程。
⽬前使⽤微流控芯⽚进⾏指导⽤药的多基因位点平⾏检测是主要临床应⽤领域。
⼆核酸序列测定
⼆核酸序列测定
测序反应是直接获得核酸序列信息的唯⼀技术⼿段，是分⼦诊断技术的⼀项重要分⽀。虽然分⼦杂交、分⼦构象变异或定量PCR技术在近⼏年已得到了长⾜的发展，但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上，因此对基于特定基因序列检测的分⼦诊断，核酸测序仍是技术上的⾦标准。
(⼀)第1代测序
1975年Sanger与Coulson发表了使⽤加减法进⾏DNA序列测定的⽅法，随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型，为核酸测序时代的来临拉开了序幕。
Sanger等[12]于同年提出的末端终⽌法(Sanger测序法)利⽤2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进⾏测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸⼆酯键,DNA合成反应便会终⽌。如果分别在4个独⽴的DNA合成反应体系中加⼊经核素标记的特定ddNTP，则可在合成反应后对产物进⾏聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射⾃显影，根据电泳条带确定待测分⼦的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上，于1986年推出了⾸台商业化DNA测序仪PRISM 370A，并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射⾃显影检测体系。该公司于1995年推出的⾸台⽑细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量⼤⼤提⾼。Sanger测序是最为经典的⼀代测序技术，仍是⽬前获取核酸序列最为常⽤的⽅法。
(⼆)第2代测序
1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)
不同于Sanger测序法所使⽤的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的⽅法-焦磷酸测序。其基本原理是利⽤引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值⾼低判断与其相匹配的碱基数量。由于使⽤了实时荧光监测的概念，焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷⽐例的定量，因此在SNP 位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测⽅⾯应⽤⼴泛。由于荧光报告原理不同，其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提⾼到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较⾼,⽬前尚未得到⼤规模的临床使⽤。
2.⾼通量第2代测序
⽬前常见的⾼通量第⼆代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等，其均为通过DNA⽚段化构建DNA⽂库、⽂库与载体交联进⾏扩增、在载体⾯上进⾏边合成边测序反应，使得第1代测序中最⾼基于96孔板的平⾏通量扩⼤⾄载体上百万级的平⾏反应，完成对海量数据的⾼通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进⾏真正的组学检测，在指导疾病分⼦靶向、绘制药物基因组图谱指导个体化⽤药、感染性疾病的病原微⽣物宏基因组鉴定及通过母体中胎⼉DNA信息进⾏产前诊断等⽅⾯已经取得了喜⼈的成绩。然⽽，由于该技术需要对DNA进⾏⽚段化处理，测
序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp)，需要对数据进⾏⼤规模拼接，因此对分⼦诊断⼯作者掌握⽣物信息学知识提出了更⾼要求，以利于后期的测序数据分析。
(三)第3代测序
第3代测序技术的核⼼理念是以单分⼦为⽬标的边合成边测序。该技术的操作平台⽬前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳⽶孔技术等。该技术进⼀步降低了成本，可对混杂的基因物质进⾏单分⼦检测，故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是⽬前其进⼊产品商业化，并最终投⼊临床应⽤仍有很长的距离。
三基于分⼦构象的分⼦诊断技术
(⼀)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)
1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利⽤核酸序列变异所导⾄双链变性条件差异与单链空间折叠差异，通过变性与⾮变性PAGE对变异序列进⾏分离鉴定的⽅法，即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分⼦在空间构象上的差异，通过特定条件下电泳速率的变化进⾏检测。正因为核酸分⼦构象具有序列特异性，且对于序列的改变⾮常敏感，常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进⾏PCR后开盖电泳的操作，现已不常见于临床检测。
(⼆)变性⾼效液相⾊谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)
侠女(⼆)变性⾼效液相⾊谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)
1997年,Oefner和Underhill建⽴[17,18]了利⽤异源双链变性分离变异序列、使⽤⾊谱洗脱鉴定的技术，称为dHPLC，可⾃动检测单碱基置换及⼩⽚段核苷酸的插⼊或缺失。对于存在⼀定⽐例变异序列的核酸双链混合物，其经过变性和复性过程后，体系内将出现2种双链:⼀种为同源双链，由野⽣正义链-野⽣反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链；另⼀种为异源双链，即双链中1条单链为野⽣型,⽽另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因存在错配区⽽更易变性，被⾊谱柱保留的时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从⽽在⾊谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使⽤了较⾼分析灵敏度的⾊谱技术进⾏检测，可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是，由于该技术主要通过异源双链进⾏序列变异检测，其不能明显区分野⽣型与变异型的纯合⼦。
(三)⾼分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)
2003年,Wittwer等[19]⾸次⾰命性地使⽤过饱和荧光染料将PCR产物全长进⾏荧光被动标记，再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进⾏鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进⾏序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后，若存在序列变异杂合⼦，则形成异源双链，其熔解温度⼤⼤下降。此时由于
双链被饱和染料完全填充，其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合⼦⽽⾔,HRMA也可利⽤其较⾼的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定，但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合⼦变异则⽆法有效区分。
如何利⽤DNA构象对序列进⾏推测，从⽽避免成本较⾼的序列测定或操作繁琐的杂交反应⼀直是分⼦⽣物学研究与应⽤的热点问题。⽬前，使⽤构象变化对序列变异进⾏间接检测的便捷性已得到⼀致肯定，尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是，由于基于构象变化的分⼦检测⼿段多⽆法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进⾏严格的保证，因此其只适合⼤规模的初筛,⽽真正的确诊仍需要进⾏杂交或测序的验证。
四定量PCR(quantitative PCR,qPCR)
世博文化中心
相⽐于其他分⼦诊断检测技术,qPCR具有2项优势，即核酸扩增和检测在同⼀个封闭体系中通过荧光信号进⾏，杜绝了PCR 后开盖处理所带来扩增产物的污染；同时通过动态监测荧光信号，可对低拷贝模板进⾏定量。正是由于上述技术优
势,qPCR已经成为⽬前临床基因扩增实验室接受程度最⾼的技术，在各类病毒、细菌等病原微⽣物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达⽔平监控等多种临床实践中得到⼤量应⽤。但伴随着qPCR技术的迅猛发展，有关这项技术的质量管理问题也⽇益突出，如何消除各类
⽣物学变量所引起的检测变异，减少或抑制实验操作与⽅法学中的各种⼲扰因素是qPCR技术⾯临的难题。
(⼀)实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1.双链掺⼊法
1992年Higuchi等[20-21]通过在PCR反应液中掺⼊溴⼄锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进⾏测定，提出了使⽤荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线，定量反应体系中初始模板的反应动⼒学(real-time PCR)模型，开创了通过实时闭管检测荧光信号进⾏核酸定量的⽅法。核酸染料可以嵌⼊DNA双链，且只有嵌⼊双链时才释放荧光，在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度，绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线，以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct)，则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系，推断初始模板量。随后Morrison[22]提出了使⽤⾼灵敏度的双链染料SYBR Green I进⾏反应体系中低拷贝模板定量的⽅法。这⼀⽅法操作简便，但由于仅使⽤扩增引物的序列启动核酸扩增，其产物特异性⽆法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进⾏检验，但其特异性明显逊于使⽤荧光探针进⾏检测，因此双链掺⼊法并未在临床实践中得到认可。
2.Taqman探针
由于双链掺⼊法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使⽤Taqman探针进⾏qPCR的⽅法。TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针，在探针的5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团，利⽤Taq酶具有5'3'外切酶活性，在PCR过程中⽔解与靶序列结合的寡核苷酸探针，使荧光基团得以游离，释放荧光信号。从⽽使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光，通过real-time PCR的原理对其进⾏定量。由于其超⾼的特异性与成功的商品化推⼴,Taqman探针已经成为⽬前临床使⽤最为⼴泛的qPCR⽅法，其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等⽅⾯具有着不可替代的地位。
3.分⼦信标
同样在1996年,Tyagi等[24] 提出了使⽤分⼦信标(moleuclar beacons)进⾏qPCR的⽅法，分⼦信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针，其两端具有互补的⾼GC序列，在qPCR反应液中呈发夹结构，荧光基团与淬灭基团发⽣荧光共振能量转移(FRET)⽽保持静息状态。当PCR反应开始后，茎环结构在变性⾼温条件下打开，释放荧光；在退⽕过程中，靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性，不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构⽽荧光淬灭，通过检测qPCR 体系中退⽕时的荧光信号强度，便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相⽐于Taqman探针，分⼦信标使⽤发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,⼤⼤降低了检测的荧淋巴肉瘤
光背景，其检测特异性较Taqman探针更⾼，更适合等位基因的分型检测。
4.双杂交探针
1997年,Wittwer等[25]发表了使⽤分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进⾏qPCR的⽅法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有⼀定重叠，且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时，供体与受体基因得以接近，从⽽通过FRET发⽣能量传递，激发荧光信号，荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正⽐。由于使⽤了2条探针进⾏靶序列杂交，该⽅法的特异性⽐传统单探针检测体系得到了极⼤地提升。
(⼆)数字PCR
早在上世纪90年代就出现了使⽤微流控阵列对单次qPCR反应进⾏分散检测的概念。基于这⼀理念,Vgelstein与Kinzter[26]于1999年发表了数字PCR(digital PCR)的⽅法，对结肠癌患者粪便中的微量 K-RAS基因突变进⾏了定量。相⽐于传统的qPCR⽅法，数字PCR的核⼼是将qPCR反应进⾏微球乳糜液化，再将乳糜液分散⾄芯⽚的微反应孔中，保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。经过PCR后，对每个微反应孔的荧光信号进⾏检测，存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号，没有靶模板的反应孔就没有荧光信号，以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此，数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进⾏绝对定量的qPCR反应,⽽⾮以模板Ct值进⾏核酸定量的real-time PCR。
经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是⾸款商品化的数字PCR检测系统,⽬前已被⼴泛运⽤于微量病原微⽣物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相⽐较，该技术具有超⾼的灵敏度与精密度，使其成为⽬前qPCR领域的新星。
经络诊断仪五对未来5年的展望
半个世纪以来分⼦诊断的⾼速发展离不开分⼦⽣物学技术⽇新⽉异的进步。概⽽⾔之，在过去的50年中分⼦诊断技术取得了三⼤转化与3项提升：即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化，操作⽅法由⼿⼯操作向全⾃动化转化，检测分析通量从单⼀标志物向⾼通量多组学联合判断转化；检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。
在未来5年中，我国分⼦诊断事业将迎来两⽅⾯的进步。随着卫⽣监管部门对分⼦诊断重要性的认识不断深⼊与越来越多⾼学历、⾼素质⼈才的进⼊，分⼦诊断将会出现理念的⾰命性进步,⾼通量技术将更多的进⼊临床的实际应⽤中。随着技术的进⼀步发展，传统针对特定基因异常、病原微⽣物感染鉴定的⽅法学，也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长⾜的进步。对于传统⼈⼒与时间成本较⾼的检测⽅法学，将出现两极分化的态势，即Southern等经典的检测⾦标准将得到保留;⽽ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满⾜实际临床需求的⽅法将快速被新型技术所取代。最终，分⼦诊断也
必将⼀改⽬前仅仅⽤于病原微⽣物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局⾯，形成由肿瘤学、遗传学、微⽣物学、药物基因组学四⾜⿍⽴，快速发展的景象。
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