甲苯胺蓝中图分类号:R446 文献标识码:B免疫学检验颜补偿实时定量PCR及熔解曲线快速检测载脂蛋白E基因突变* 樊锦秀1，陈 琪1，张黎明2，朱慧民1，金国健3，王爱华4，朱 红2(1.台州市中心医院老年医学研究所重点实验室，浙江318000;2.检验中心;3.老年科;4.B超室)
摘要：目的 探讨应用颜补偿实时定量PCR及熔解曲线快速检测载脂蛋白E基因两个密码子突变及临床应用价值。方法
选取60岁以上老年非酒精性脂肪肝(NAFL)108例和体检正常老年者96例为研究对象。首先以LC R ed640和LC R ed750标记两条针对112和158位编码子的检测探针5 端，相应的锚定探针在3 端被荧光标记，再从人基因组DNA中快速循环PCR 特异引物扩增apoE基因265bP片段并与特异探针杂交后，引发荧光共振能量转移，通过异源杂交的出现和错配碱基的类型的熔解参数来完成野生型和突变基因分型。结果 峰值对应着序列特异的熔解温度点，各基因型的模板均呈现良好的峰形。NAFL组以杂合子E2/3、E3/4基因型频率最高，与正常组比较差异有显著意义(P<0.05)，分布频率为E2/3(35%)、E3/4 (25%)、E3/3(35%)、E2/4(2%)、E4/4(2%)、E2/2(1%);NA FL组E4/4频率高于对照组;NAFL组apoE基因总浓度表达水平明显升高(P<0.05)。结论 采用PCR结合熔解曲线法进行apoE基因多态性检测，其操作简便省时，不易交叉污染；获得的各种基因类型特征性强，适用于临床快速诊断分型。apoE基因多态性与老年NA F L存在相关性，携带E3/4、E2/3型或E4/ 4型的个体存在，提示对老年NAFL遗传易感性方面起到重要作用。
泛华建设集团关键词：载脂蛋白E；基因多态性；实时定量PCR；熔解曲线；非酒精性脂肪肝
载脂蛋白E(apo li p oprote i n E,apo E)具有明显的遗传多态性，其与受体亲和力的差异和突变是导致基因多态性而影响脂质代谢的结构基础。近年诸多研究表明[1-2],apo E基因及其多态性与多种疾病的发生有着密切关系，为了诊断和流行病学研究,apoE 基因分型倍受重视，其检测方法也有多种[3]，主要经PCR扩增后，依赖限制性酶切，琼脂糖或丙烯酰胺凝胶分离DNA片断并RFLP分析。但非常耗时，而且要求PCR反应非常特异，否则影响基因分型。为了快速简便，在一个PCR反应中同时分析两个密码子的多态性，我们应用高速热循环PCR和荧光共振能量转移结合熔解曲线的方法在L i g ht Cycler T M 2.0PCR仪进行apoE基因分型，检测非酒精性脂肪肝(non alcoho lic fa tty li v er,NAFL)患者血液，研究其遗传易感危险因素，以遗传基因变异的角度探讨NAFL与apoE基因多态性的关系，使其成为常规检测方法用于临床早期诊断、早期干预心脑血管脂质代谢综合征等疾病的实验研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 来源于健康体检者。按中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性脂肪肝病学组非酒精性脂肪性肝病诊断指南[4]标准,NAFL组108例，男性50例，女性58例，年龄60~85岁，平均67.65.9岁；
正常对照组96名均系查体正常的老年健康者，男性45名，女性51名，年龄60~87岁，平均67.55.5岁。
1.2 仪器和试剂 L i g ht Cycler TM
2.0型荧光实时定量PC R仪,apo E基因检测试剂、熔解曲线分析软件购自Roche诊断公司；琼脂糖、EB、DNA提纯试剂购自杭州迪安医疗公司；美国B I O RAD电泳仪; apoE、apoE4浓度检测EL I SA试剂购自浙江大学生物工程公司，美国Farxt 100型酶标仪。
1.3 标本采集 取患者空腹静脉血3m,l其中1m l 分离血清,-86!保存用于apoE、apoE4浓度检测。
1.4 DNA的提取 另取2m l血液用EDTA K2抗凝，采用H igh pure PCR模板提取试剂盆提取核酸。再用美国贝克曼DU 800核酸定量分析仪测定DNA 浓度,260nm吸光率>0.05,DAN含量>
2.0 g/ ,l 吸光率A260/A280比值在1.6-1.8之间。
1.5 扩增apo E基因引物及探针 均由Roche诊断公司合成。设计一对针对apoE基因的特异PCR引物，序列P1(上游引物):5 TTGAAGGCCTA CAAATCGGAACTG-3 和序列P2(下游引物):5 -CCGGCTGCCCATCTCCTCCATCCG-3 。检测的目标序列为apoE基因的第四外显子，检测的突变位点是112位和158位编码子，扩增片段长度为265bp。
*基金项目：台州市科技局科技计划基金资助项目(043244)
充当相应的锚定探针1用荧光素标记其(离探针2大约1-3个碱基)3 末端与无突变的靶序列杂交，探针2中第112位和115位密码子的5 末端则用荧光LC R ed640荧光基团或LC Red705荧光基团标记，横跨突变位点(突变探针)。此两个探针在与扩增出的DNA片段杂交时，两种荧光素能互相接近(间隔1-5个碱基)，以使能够进行FRET。
1.6 实时荧光定量PCR反应体系 基因组DNA 的变性：以20!/sec加热速率使之达到95!并孵育1m i n。按照下列比例构建扩增及杂交的反应体系:1 l无菌水,2 l apoE反应混合液,4 l变性检测混合液,2 l已变性的人基因组DNA液。按照下列参数进行45次PCR循环扩增:95!变性0sec, 60!退火10sec,72!延伸10sec。通过特异配对荧光杂交探针检测扩增物进行核酸扩增及其扩增子与特异探针的杂交，杂交探针两种分别带不同标记的寡核苷酸，在PCR循环退火时结合到扩增片段内部，设置程序进行扩增子的杂交:95!高温变性30秒,42!退火杂交4分钟,80!中温复性0sec，并在体系达到80!时检测其荧光量值。质控模板、阴阳性对照和标本同样处理。
1.7 熔解曲线结果分析 以阴性对照的荧光量为纵坐标，温度为横坐标，使熔解曲线转换成熔解温度(Tm值)。apo E基因第112位密码子和158位密码子碱基序列的判断：在L i g ht Cycler data analysis页面，分别选择F2或F3荧光通道，点击M elti n g Curve 按钮执行熔解曲线分析程序，应用颜补偿系统及熔解曲线分析直接检测出样本的基因型。1.8 统计学处理 数据以x s表示，采用SPSS for W i n dow s1
2.0版本软件行t检验分析apo E、apoE4浓度结果，基因频率用基因记数法计算，频率基因比较用 2检验。
2 结 果
2.1 熔解曲线载脂蛋白E基因分型判断 见封
(3)图1-2，因为突变探针的Tm值比锚定探针低, Tm值不仅取决于G+C含量和碱基对长度，而且还取决于突变探针和DNA模板的同源性，如果有一突变出现，突变探针与靶序列的不配对会降低杂交体的稳定性。在荧光信号监视下，依靠异源双链核酸分子不匹配时熔解温度较低，不同熔解特性的基因型可被获得。对野生型基因型，不配对情况不会出现,F2、F3两个通道112位点和158位点均显示单峰为纯合子，见封3图1蓝峰和封3图2绿峰。杂交体的Tm较高，如慢慢增加温度，当突变探针溶解令两个荧光染料不再接近时，荧光便会减少。对于带突变的基因型，此改变会在较低温度出现,F2或F3通道其中一通道可出现双峰为杂合子。见封3图1蓝峰和红峰。
2.2 老年NAFL组与正常对照组apo E基因型的频率和apo E表达水平 见表1。本实验共检出6种基因型,NAFL组与正常对照组比较有显著差异(P <0.01)，分布分别为E2/3,E3/3,E3/4,E4/4,E2/2和E3/3,E3/4,E2/3,E4/4;E3/3型呈负相关。NAFL组apoE、apo E4基因表达明显上调，尤以总apoE差异非常显著(P<0.01)，此结果与基因型分布频率结果相符。热流道技术
手机回收系统
表1 NAFL组与正常对照组apoE基因型的频率、apoE和apoE4浓度比较[例(%)]组别n E2/2E2/3E2/4E3/3E3/4E4/4apoE ng/m l apoE4ng/m l 对照组960(0)10(10)2(2)64(67)20(21)0(0)49.826.335.022.7 NAFL组1081(1)38(35)*2(2)38(35)*27(25)*2(2)99.373.3*46.435.3∀注：与正常对照组比较:*P<0.01;∀P<0.05
2.3 批量样本DNA熔解曲线荧光量变化比较 见图1，双LC Red640和LC Red705所发射的荧光被通道F2和通道F3持续检测到，在缓慢升温过程中发生的单链染体DNA和荧光标记探针的不匹配性，各自通道记录的荧光信号被转变成熔解峰值。熔解曲线图显示每个待测样本随温度升高其荧光量逐渐减少，当温度升至其Tm值时其荧光量急剧下降,2
种类型的模板均呈现良好的峰谷。
图1 批量NAFL患者血液DNA LC R ed640和
LC R ed 705F2、F3通道荧光量变化
3 讨 论
NAFL已成为当今的常见病和多发病，发病率达20%，它常与肥胖症、高脂血症、高血压、糖尿病和高尿酸血症等代谢综合征并存亦是多数隐源性肝硬化的病因之一[5-6]，为全球关注的医学和社会问题。不同载脂蛋白的突变及多态性常导致脂蛋白代谢紊乱和心血管疾病的易发性。人类apo E位点的遗传变异是体液内脂质浓度的一个重要决定因子，是导致个体间血脂和脂蛋白代谢水平差异的常见遗传因素之一[7]。为寻适合检测apoE基因突变常规方法，筛选对NAFL高危人和早期NAFL患者采取干预措施提供可靠依据。本研究应用实时定量PC R(双检测法)结合熔解曲线，通过异源杂交的出现和错配碱基类型的Tm值来检测野生型和突变基因分型，具有灵敏度高、准确性高、操作简便、快速且经济实用等优点。特别是L i g ht Cycler仪器本身作为一个整合系统来完成变性和荧光检测工作，密闭的毛细玻管，使污染最小化，整个过程在50分钟内自动完成，是临床上较理想的apoE基因多态性研究方法。
研究结果表明:NAFL以E2/3、E3/4型杂合子为主，分布频率与正常对照组之间比较有显著性差异，总apoE基因表达明显上调，两者相符。杂合子的个体血清总胆固醇和甘油三脂浓度也增高[8]。提示apoE和HDL的清除率有关，对胆固醇的反向运输有作用。E2、E3、E4这3个共显性编码共为299个氨基酸残基蛋白质基因的遗传基础在于第112位和第158位的密码子，这种多态性的分子基础源于多态链第112位和158位单个氨基酸的替换。此实验方法为达到同时检测双突变位点目的，设计两根双不同的荧光基团标记，其中含有变异的核酸位点，在PCR循环中，杂交探针杂交特异的PCR产物在合适的退火温度，荧光被检测到。由于玻璃毛细管的高表面积和体积比，循环的温度条件变化非常快。PCR一结束，产物被变性，温度降到40度以下利于杂交探针的结合，荧光信号最强，然后缓慢升温到80度，检测探针逐渐解离，荧光信号的下降被连续记录下来。apoE4突变体(112位和158位都是精氨酸)和胆固醇升高有关，三种异构体E2/3、E3/4和E2/4与受体的亲和力不同常影响脂质摄取、降解，而造成脂肪在肝脏堆积，增加了心血管疾病的风险。E2/3、E3/4均为遗传易感基因，携带者尚可能通过遗传易感机制发挥作用，从而揭示了E2/3、E3/4导致中心性肥胖NAFL 发生的见解。
当标记有LC Red640和LC Red705杂交探针在同一微细管，应用单个通道时，一方面提供有效的FRET，同时也产生最少的光谱交叉，此现象使用颜补偿系统加以改正。因此产生荧光信号具有特异性,3种不同基因型的DNA标本产生的荧光信号不一样，如有污染的非特异性的PCR产物不会影响结果。在一个PCR反应中，同时加入所有的杂交探针，能够在某些标本中确认单个熔解峰，但琼脂糖凝胶电泳却显示相同数量的产物。证明本方法具有较高的特异性和临床推广应用价值。
参考文献:
[1]李 昕，张柏丽.载脂蛋白E基因与人类多种疾病相关性及检
测方法的研究进展[J].医学综述,2005,11(9):839-841. [2]Y il m az H,Isb i r T,Agachan B el a,l Is ep silon4allel e of apo li pop ro
tei n E ass oci ated w ith m ore severe end or gan da m age i n essen tial hypertens i on[J].C ell B i oche m Fun ct,2001,21(1):191-195. [3]H i xson J E,V ern i er DT.Restricti on i sot ypi ng of hum an apo li pop ro
tei n E by gene a mp lifi cati on and cl eavage w ith Hh aI[J].J L i p i d Res,1990,31(1):545-548.7.22事件
[4]中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性脂肪肝病学组.非酒
精性脂肪性肝病诊断指南[J].中华肝脏病杂志,2006,14(4): 161-163.
[5]You ssef W I,M cCu ll ough A J.Steatohep atitis i n obese i nd i v i dual s
[J].Best Pract Res C li n Gastroen tero,l2002,16(5):733-747. [6]林 学，陈 敏.老年非酒精性脂肪肝与相关疾病的关系[J].
广西医学,2006,28(9)1362-1364.
[7]Ruth FS,B irgit AL,Peter S,et a.l Con t ext d ependen t and i nvari ant
associati ons bet w een lipids,li poprotei ns and apoli poprotei n s and li po p rotein E genotype[J].J L i p i d Res,2000,41(11):1812-1822. [9]樊锦秀，金国健，朱慧民，等.老年人非酒精性脂肪肝与载脂蛋白
E基因多态性关系的研究[J].中华老年医学杂志,2006,25
(6):428-430.
中图分类号:R446.62 文献标识码:A
慢性乙型肝炎患者外周血CD80、CD86及其受体CD28表达临床意义的研究
周永列1，邱莲女1，陈永健1，李洪波2，林惠君1，刘建栋(1.浙江省人民医院医学检验中心，杭州310014;2.杭州市传染病院)
摘要：目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血协同刺激分子CD80、CD86及其受体CD28与其病情和H B V复制的关系。方法
用流式细胞术检测了24名健康体检者和92例不同临床分级的慢性乙型肝炎患者外周CD80、CD86、CD28的表达和CD8+/ CD28+、CD8+CD28-亚淋巴细胞，并与病毒载量和HBeA g进行相关分析。结果 慢性乙型肝炎组淋巴细胞CD80和CD86及单核细胞CD80的表达分别为(7.633.09)%、(11.985.12)%、(10.734.51)%，明显高于正常对照组(2.75 0.81)%、(3.381.47)%、(4.681.13)%和慢性乙肝病毒携带组(3.401.51)%、(4.482.34)%、(5.912.52)%；肝炎后肝硬化组(10.275.58)%、(15.547.91)%、(14.215.45)%明显高于慢性乙肝组；慢性乙肝病毒携带组与正常对照组比较有升高趋势，但均无显著性差异；慢性乙型肝炎轻、中、重度三组间也存在显著性差异。慢性乙型肝炎组淋巴细胞CD28的表达为(41.7811.72)%，明显低于正常对照组(52.647.71)%和慢性乙肝病毒携带组(49.157.58)%，但与肝炎后肝硬化组(39.219.53)%无显著性差异。慢性乙型肝炎组与正常对照组和慢
性乙肝病毒携带组比较,CD8+/CD28+亚明显降低而CD8+CD28-亚显著升高。病毒载量高低和HBeA g是否阳性与外周血CD80、CD86及CD28和CD8+/CD28+和CD8+CD28-亚淋巴细胞无显著性差异。结论 协同刺激分子CD80、CD86及受体CD28可能在慢性乙型肝炎免疫损伤过程中起重要作用，但与血清中病毒载量的变化和HBeA g是否阳性无关。
肖秉林关键词:CD80;CD86;CD28；共刺激分子；乙型肝炎；慢性
乙型肝炎病毒(H B V)是一种非细胞毒性病毒，细胞免疫应答在抗H B V感染中发挥主要作用，并且与乙型肝炎的发病机制密切相关。HBV感染后引起的肝细胞损伤主要通过机体对病毒感染后肝细胞的杀伤所致。HBV特异性杀伤T细胞作用被认为是引起肝损害和清除病毒的中心机制。H B V感染后所致的不同临床类型和结果与机体的免疫状态关系密切。机体对病原体的特异性免疫应答机理十分
H igh speed apoli poprotei n E genotypi ng usi ng R eal T i m e
Fluorescence PCR w ith color co mpensation and m elti ng curves
FAN Jin x i u,C HEN Q,i Zhang Li m ing,et al.(L aboratory o f G er i atric R esearch,Centra l H osp ital o f T a i zhou,T a iz hou 318000,Ch i na)
Abstrac t:Ob jec ti ve T o i nv esti g ate the i m portant value of high speed apo li popro te i n E(apoE)
genotypi ng using R eal T i m e F l uores cence PCR w it h co l o r compensati on(dua l co l o r detection m ethod)and m elti ng curves i n analysis o f the t wo po l ymo rph ic codons i n a si ng le reacti on.M ethods H ealth ex a m i ned persons e l der t han60y ea rs o ld screeni ng i nclud i ng108non a l coho li c fa tty liver(NA FL) persons and95health e l der.T he detection probes cover i ng codons112and158are5 labe led w ith L C red640and LC R ed705.T he co rrespondi ng ancho r probes a re fl uoresce i n l abeled at their3 ends.T hen,a265 bp fragment of the apoE gene is a m plified from hu m an genom i c DNA,produc i ng FR ET.D epending on t he presence and type of base pair m i s m atch i n the heterodup l ex,w il d type and m utant type w ere d ifferen tiated.Resu lts The peaks represent the sequence spcific m e lti ng po i nts(Tm),m eanwh ile each gene t ype sho w s counte rt s and per fec t peak.E2/3、E3/4i n NAFL w ere much m ore comm on a lle l e than hea lt h persons(P<0.05),t he frequenc i es w ere E2/3(35%)、E3/4(25%)、E3/3(35)、E2/4(2%)、E4/4(2%)、E2/2(1%);E4/4i n NA FL is higher than that o f contro l g roup,T he expression o f apoE w as up regulated(P<0.01).Con clusi on A po li popro tein E genotyping usi ng PCR and m e lti ng curv e are faster and s i m p l er t han o t her techn i que,w hich can prevent t he cross conta m i nated and suitabl to app l y i n c li n ic qu i ck diagnosis. T h i s m ethod can show a h i gh sepcific it y.T he re is po siti ve re l a ti onsh i p be t w een t he e l der s NAFL i n apoE g ene po ly m orphis m.E3/4、E2/3or E4/4have t he i m portant ro le in the e l der s NAFL on gene ti c suscepti b ili ty.
K ey word s:A po li poprote i n E;G ene po ly m orphis m;R ea l ti m e PCR;M e lti ng curves;N on a lcoho li c fatt y li ve r
(收稿日期:2007 05 28，修回日期:2007 06 28)
(本文编辑：杨仲国)
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议