动物医学进展,2006,27(1):35-38
Progress in Veterinary Medicine
赵 俊，童德文＊，李 立，刘文明，邢明辉
(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵712100)
中图分类号:Q511;R730.4;R730.5文献标识码:A文章编号:1007-5038(2006)01-0035-04
摘 要：单链抗体(ScFv)是将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，也是目前报道最多的基因工程抗体。ScFv具有分子质量小，免疫原性低，无Fc端，不易与具有Fc受体的靶细胞结合，对肿瘤组织的穿透力强，可以与其他效应分子连接成抗肿瘤融合蛋白等特点，是保持抗体亲和性和特异性的最小功能性抗体片段，广泛应用于医学和生物技术研究领域。文章介绍了ScFv的特点、基因来源、构建、表达及其在肿瘤的诊断和中的应用研究进展。 关键词：单链抗体；肿瘤
1975年M ilstein和Ko hler将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合，成功地建立了单克隆抗体技术，并在临床诊断和基础研究中发挥越来越广泛的作用，但在疾病中还没达到满意的效果，主要原因是目前大多数单克隆抗体来源于鼠类，在人体容易产生较强的人抗鼠抗体(human anti-m ouse anti-body,HAM A)反应。而且鼠单抗生产成本较高，难以大规模普及应用。随着分子生物学技术的发展, H uston J S等[1]和Bird R等[2]结合DNA重组技术成功制备了单链抗体(ScFv)，具有完全抗原结合位点，大小为完整抗体的1/6，分子质量约为27ku，还具有在非靶向组织滞留时间短，组织穿透力强，血液清除快，可在体外筛选等优点。更重要的是ScFv能
收稿日期:2005-10-13
基金项目：国家自然科学基金(30371067)；霍英东教育基金(91033)
作者简介：赵 俊(1981-)，男，贵州瓮安人，硕士研究生，主要从事细胞病理及毒理研究。＊通讯作者
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The Coagulant FactorⅩa Inhibitors from Haematophagous Invertebrate
JIANG Xiang-mei
(Depar tmen t o f Par asitolog y,C o llege o f Basic Medicine,Chong qing University o f Medical S cience,Chong qing,400016,China)
A bstract:This pape r summa rized the blood co ag ulation pathw ay s,the ro les of co ag ulant factorⅩa.Facto r Ⅹa is very important in coagulant pathw ay in v ivo o r vitro,and m ay be a key target of a new developing anticoag ulant.Coagulant facto rⅩa inhibitor has been a researching ho t point of anticoagulant fo r a few y ears.Various coagulant facto rⅩa inhibitors have been isolated from haematophago us inv ertebrates since the discovery of hirudin in1955.They may be further studied and recombined by gene pro ject techno logy and co nve rted as new anticoagulating com pounds that are stronger activity and more functio n,and w ill be the pro mising inhibito rs in antithrom bus application.It w ill provide a no vel direction to develop clinical an-ticoagulant.
Key words:invertebrate;antico ag ulant;facto rⅩa;peptide
DOI:10.16437/j ki.1007-5038.2006.01.010
在细菌中表达，易于基因操作和大量生产，并可构建与其他效应分子连接的抗肿瘤融合蛋白，从而将药物导向肿瘤，在肿瘤显像和中具有广阔的应用前景。
1 ScFv的特点
ScFv是在DNA水平上将抗体重链可变区(V H)和轻链可变区(V L)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组蛋白，有完全抗原结合位点，分子质量小，作为异种蛋白的免疫原性低；对肿瘤组织的穿透力强，易进入实体瘤内部；血液中半衰期短，体内清除速度快；体内显像时，因不具Fc端，明显优于单克隆抗体和Fab抗体片段；可在原核细胞中表达，易于基因操作和大量生产。但也存在缺点，如只有一个抗原结合位点，稳定性低，亲和力下降，不能发挥抗体Fc端介导的免疫效应等。
2 ScFv的基因来源
下行频率杂交瘤细胞、B淋巴细胞和脾脏细胞中提取总RNA，用总RNA或提纯m RNA逆转录合成cD-NA，并以此为模板扩增V H和V L基因。
3 ScFv的构建
ScFv构建的基本原理是从杂交瘤细胞或淋巴细胞中提取mRNA，经RT-PCR扩增V H和V L基因，人工合成一条Linker将V L的C端与V H的N 端或V H的C端与V L的N端连接成ScFv基因，然后在合适的表达系统中表达。目前使用较多的Linke r序列是H uston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构的15肽序列(Gly4Ser)3。
ScFv的构建还取决于Linker的选择,Linker 的长度和序列对ScFv的表达水平、稳定性、亲和性等有重
要的作用。理论上，理想的Linker需保证V H和V L在表达系统中等摩尔产生，不干扰V H、V L 的自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，不引起分子动力学的改变，尽可能减少蛋白酶攻击及防止S cFv的聚集等条件[4]。利用噬菌体展示技术人们随机构建了Linke r文库，不过常用的还是H usto-n构建的(Gly4Ser)3。
4 ScFv的表达系统
4.1 原核细胞
目前，多数ScFv是在E.c oli中表达的,E.c oli 遗传背景清楚、培养操作简单、转化率高、成本低廉。
E.c oli表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，是应用最广泛的蛋白表达系统。主要以3种方式表达[5]:①直接在细胞质中以包涵体形式表达。方法简单，不需信号肽，但产生的蛋白常没有活性，需经过体外溶解、复性、折叠等诸多步骤，才有可能获得活性;②与菌体蛋白融合，表达融合蛋白。ScFv的N端或C端都可以与其他的分泌蛋白如葡萄球菌蛋白A融合分泌到外周质中，将外膜破坏后，融合蛋白可以通过IgG亲和柱纯化;③分泌表达功能性ScFv，此方法是近年常用的表达方法。在信号肽M el、Om pA、PelB等的引导下，被分泌到E.c oli的外周质或培养液中，并完成二硫键的形成和肽链的折叠，表达为有活性的产物。
4.2 真核细胞
表达ScFv的真核细胞有酵母细胞、CHO细胞和植物细胞等。真核细胞具有完整的细胞装置，产生的抗体与天然蛋白质一样能形成链间和链内二硫键，维持正确构象和翻译后糖基化加工，并分泌到细胞外，成为功能性抗体。Eldin P等[6]用酵母细胞分泌表达了两种不同的ScFv，最高水平达到250m g/L，与E.c oli表达同种ScFv比较，抗原亲和力没有改变。
4.3 植物
小鼠单抗、重组鼠-人嵌和抗体、ScFv等抗体可在植物叶子和果实中表达，而不失去特异性与亲和力。Paraskevi在烟草中表达抗AMCV(arichoke m ottled crinkle virus,AMCV)的ScFv，产量达叶片总蛋白的0.1%，所表达的抗体都有活性[4]。目前胞浆中表达只用于生产ScFv，可能ScFv仅需要简单的翻译后加工，虽有其局限性，但植物抗体的出现使农业大规模生产抗体成为可能[7]。
4.4 噬菌体
噬菌体展示技术应用于ScFv筛选，可从淋巴细胞中提取m RN A，避免从杂交瘤细胞提取m RNA 的费时工作。其优点:①表达抗体产量高，特异性强，便于筛选;②可构建人的抗体可变区全库基因，为生产人型抗体奠定理论基础。表达载体包括噬菌体和噬菌粒，噬菌体载体比较稳定，但转化率较低。噬菌粒是噬菌体和质粒的杂合体，是目前应用最多的表达载体，也是高效模拟B细胞产生抗体的原核表达系统。由于噬菌粒不含有噬菌体全部遗传信息，故感染细菌后需辅助噬菌体(M13K07或R408)的援
救。噬菌粒基因组小，易于操作，可插入较大基因片段，转化率高，需辅助噬菌体，有时不稳定。目前人们也对表达载体进行改建，如以pBluescript构建的pComb3和PCBAK8，以pUC和PGC1构建的pTac cp等[5]。这些载体在表达抗体时产量高，活性强，易于筛选。
36动物医学进展 2006年 第27卷 第1期(总第147期)
5 ScFv在肿瘤诊断中的应用
在ScFv表达和纯化等方面取得进展的同时，其用于放射性显影的优势也显示出来。如能快速进入瘤体组织，在血液循环和其他组织的廓清快，不易与非靶细胞结合，在肿瘤定位诊断时定位图像清晰。最早研究的是131I标记ScFv的肿瘤靶向的性能，现已在实验动物模型上测试了多种针对不同抗原系统的放射性标记ScFv。放射自显影研究表明,131I-CC49在肿瘤移植物内有较好的微观分布，并且在肝脏和脾脏的活度低，很可能是因为放射碘化ScFv 抗体在这些组织中去卤化的缘故[3]。Choi C W 等[8]使用的ScFv的V H和V L不是通过连接肽来连接，而是通过遗传工程二硫键来稳定，是IL-2受体(Tac)的特异抗体，在标记上18F后，在A TAC4异种移植模型注射抗体后45min得到肿瘤活性峰值为4.2%ID/g，表明在18F的半衰期内18F-ScFv抗体有很好的肿瘤定位效果。
6 ScFv在肿瘤中的应用
6.1 重组免疫毒素
ScFv基因C末端与毒素基因连接，表达得到的S cFv与毒素的融合蛋白。常用毒素有蓖麻毒素、假单胞菌外毒素PE、白喉毒素等。Wels W等[9]用构建的抗erbB-2和EGF受体ScFv免疫毒素，表达erbB-2的肿瘤，可使肿瘤缩小。
6.2 肿瘤疫苗
抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的双重作用，可作为肿瘤疫苗调节免疫网络，调动机体自身抗肿瘤免疫反应，重组的抗独特型抗体也具有同样的作用。M a J等[10]将识别人卵巢癌抗原CA125的S cFv-PDL10用于PLGA中心体包裹免疫小鼠，体内产生抗独特型抗体(AB2)，说明ScFv可模拟抗原诱导抗独特型抗体的产生，而作为一种肿瘤疫苗用于肿瘤。
6.3 ScFv与细胞因子连接表达的融合蛋白
包头医学院学报
常用细胞因子有IL-2、TNF和IFN等。Itzhak 在肿瘤基因疫苗的研究中，将用B细胞淋巴瘤38C13小鼠模型制备的ScFv分别与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-1β九肽片段构建成双功能ScFv。实验证明ScFv-IL-1β片段融合蛋白和编码此蛋白的裸露DN A一样具有免疫性，能保护小鼠免受肿瘤的攻击,ScFv-GM-CSF融合蛋白也有同样功能，但不能作为DNA疫苗[4]。
6.4 ScFv与药物代谢酶连接
抗体导向酶-前体药物疗法利用抗体的导向作用，将前体药物的专一性活化酶选择性地靶向到肿瘤组织部位，这样前体药物特异性地在肿瘤组织内转化为活性分子，从而发挥抗肿瘤作用。研究较多的是效应分子(弹头)通过化学方法与抗体连接，制成免疫偶联物，利用抗体特异性，作为导向载体，利用“弹头”杀伤肿瘤靶细胞。用作“弹头”物质主要有3类，即放射性核素、化疗药物与毒素。如将具有阻断蛋白合成功能的牛胰核糖核酸酶与抗转铁蛋白受体的ScFv偶联构成的免疫复合物，对黑素瘤肾瘤和乳腺癌细胞的蛋白合成均有很好的抑制作用[11]。
6.5 放射性同位素标记的ScFv
Geo rge A J等[12]用186Re或188Re标记，针对erb-2的ScFv741F8-1，用于肿瘤的放射免疫取得良好效果。
6.6 双特异性ScFv
将两种ScFv分子连接在一起生成具有两种不同抗原的活性分子，它的一个臂针对靶细胞表面抗原，另一个臂针对免疫活性细胞表面活性分子，从而将抗体靶向性与激活免疫细胞的杀伤功能结合起来。Uwe A等[13]改造的二价([Sc(Fv)2])和四价([S c(Fv)2]2)的ScFv多聚体，在体内的稳定性明显强于ScFv，在疾病诊断和中有潜在价值。
电视剧不如跳舞7 结语
细胞内免疫是Baltimo re提出的一个疾病的新思路，其原理是将ScFv基因导入细胞内并在亚细胞部位表达，利用抗体与抗原结合的特性，从而调节或改变细胞生物学活性，达到防病治病的目的。典型的例子就是胞内免疫艾滋病，抗艾滋病病毒外壳蛋白g p120的ScFv定位表达在细胞粗面内质网内，可以起到抑制艾滋病病毒复制的作用。随着基因工程抗体时代的到来,ScFv作为新兴的第3代抗体具有其优势：易于分子改造，与毒素、药物和放射性核素等拼接可直接杀伤靶细胞；分子小，保持原抗体分子的结合位点；穿透力强，易于进入肿瘤组织内部，可用于肿瘤诊断和。由于ScFv只有一个抗原结合位点，稳定性和亲和力都比较低，因此构建功能性ScFv多聚体和双特异性ScFv是ScFv 的改造的一个热点。
随着生物技术制药的发展，小分子抗体相关技术也得到发展和完善。特别是ScFv用于肿瘤的临床诊断和显示了巨大的潜力，国外的一些抗肿瘤ScFv现已进入体内试验阶段[14-15]。除此之外, ScFv还可以中和细菌毒素和具有抗感染的作用[16]。由此可以预见,ScFv在未来的疾病诊断和
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赵 俊等：单链抗体及其在肿瘤诊断和中应用研究进展
中将发挥重要的作用。
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ZH AO Jun,TONG De-w en,LI Li,LI U Wen-ming,XING Ming-hui
(C o llege o f Animal S cience and Veterinary Medicine,North west A&F Univers ity,Y ang ling,Sh aanxi,712100,China)
A bstract:Sing le-chain antibody(ScFv)is a veco mbinant pro tein eng ineered by linking imm unog lobulin heavy and lig ht chain v ariable domains togethe r via polypeptide linker.It has been reported mo stly in g e-netically engineered antibo dy until now.ScFv has follow ing characteristics:sm alle r mo lecule w eig ht and low er imm unogenicity,can't co njugate the Fc recepto rs of targ et cells because its Fc domains has been re-m oved,strong tum or tissue penetration,can be fo rmed anti-tumo r fusio n proteins inco rpo rating additional effect mo lecules by gene tic engineering.ScFv is the sm allest functional fragm ent of antibody that maintains the binding and specificity o f the w ho le antibody and w as used ex tensively in medicine science and biotech-nolo gy.In this paper,the prog ress in the characteristics,resource of gene,construction,expression and ap-plication of diag nosis and therapy in tumo rs of ScFv w as introduced.
Key words:single-chain antibody;tum ors
38动物医学进展 2006年 第27卷 第1期(总第147期)
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