一、免疫组织化学原理
免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 清皇陵地宫亲探记
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲
合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染技术。
二、实验准备：
1. 标本准备
①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理
②冰冻组织切片：由病理室常规处理
③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。
2. 试剂准备
①抗体选择
单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。
②二抗试剂盒
目前本实验室所用二抗试剂盒为Life Technologies Histostain-Plus Kit (HRP, Broad Spectrum)亚细亚生产方式，货号85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和教师向学生售纸豚鼠。
③DAB试剂盒
目前本实验室所用为加强型DAB显试剂盒，货号DAB-2032。
④其他试剂
凉子木二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶
3. 抗体特异性验证
所有免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。
4. 耗材准备
免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片
5. 溶液配制
①磷酸盐缓冲液（PBS）
10×PBS母液配制
NaCl 72 g
Na2HPO4·12H2O g
KH2PO4
加蒸馏水至1000 ml，充分混匀贮存。
使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至—。
②柠檬酸抗原修复液
抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：
称取柠檬酸 g，溶于500 ml蒸馏水；称取Na2HPO4·12H2O ，溶于800 ml蒸馏水。分别量取358 ml柠檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶液，充分混匀后调整pH值至，即得2×母液，贮存备用。
③1%盐酸酒精
浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。
三、免疫组化操作步骤
1. 原子核物理学组织片脱蜡水化
①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min。
②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5 min。
③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min。
④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min，取出。
⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。
2. 抗原修复
将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却。
注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染结果。切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！
3. 封闭内源性过氧化氢酶
①放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min。
②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。
阿尔福斯
③放入PBS缓冲液的玻璃缸中，浸泡5 min。
4. 抗体杂交
①甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴20 μl（试剂盒中的A液，根据组织大小调整用量），28℃放置20 min，甩干。
②加稀释好的一抗1滴（20~50 μl，根据组织块大小进行调整），置于湿盒4℃过夜。
③置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作4次，甩干。
④加入生物素偶联的二抗20~50 μl（试剂盒中的B液，根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37℃放置20 min。
⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
5. 显
①加链亲和素-辣根过氧化物酶20~50 μl（试剂盒中的C液，根据组织块大小进行调整），湿盒内28℃放置5~20 min，甩干。
②置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
③滴加新鲜配制的DAB工作液100 μl（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐时（3~5 min），置装有自来水玻璃缸中涮洗3次；
6. 复染
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