更新时间:2008-8-29 10:41:46 点击次数:124
免疫组化基本原理
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用显剂DAB显示为棕黄颗粒)。通过抗原抗体反应及呈反应，显示细胞或
组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
免疫组化操作规程
(一)、仪器设备1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉; 2)水浴锅 (二)、试剂
1)PBS缓冲液(pH7.2,7.4):NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，
Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH6.0，1000ml):柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA?2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7)封裱剂: 框剪结构
a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0,9.5)等量混合;
b、油和TBS(或PBS)配制。
8)TBS/PBS pH9.0,9.5，适用于荧光显微镜标本;pH7.0,7.4适合于光学显微镜标本。 (三)、操作流程
1、脱蜡和水化
保健食品管理办法脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60?恒温箱中烘烤20分钟。 1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟; 2)无水乙醇中浸泡5分钟;
3)95%乙醇中浸泡5分钟;
4)70%乙醇中浸泡5分钟;
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1)抗原热修复
(1)高压热修复 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95?左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有:AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase?等。 中草药大典
2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37?，切片也预热至37?，消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37?时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有:Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染
vs2008SP法
1)脱蜡、水化;
2)PBS洗2,3次各5分钟;
3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟; 4)PBS洗2,3次各5分钟;
5)抗原修复;
6)PBS洗2,3次各5分钟;
7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8)滴加?抗50μl，室温静置1小时或者4?过夜或者37?1小时。 9)4?过夜后需在37?复温45分钟。
对外贸易法
10)PBS洗3次各5分钟;
11)滴加?抗40,50μl，室温静置，或37?1小时; 12)II抗中可加入0.05%的tween-20。
木结构工程施工质量验收规范
13)PBS洗3次各5分钟;
14)DAB显5,10分钟，在显微镜下掌握染程度; 15)PBS或自来水冲洗10分钟;
16)苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化;
17)自来水冲洗10,15分钟;
18)脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5,10分钟，蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 7)滴加?抗,室温1小时或者4?过夜或者37?1小时(4?过夜后在37?复温45分钟)。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20?,37?20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC，20?,37?20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显:DAB显试剂盒或者自配显剂显(镜下掌握显程度)。 14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。
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