PCR相关问题

Q-1:
设计PCR用引物时的注意事项?

A-1:
可以从以下几个方面考虑。
1. 引物长度通常为20～25 mer。但进行LA PCR时，引物长度应增长为30～35 mer。
2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意。
3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，anyoption3′端应避开AT rich结构。
4. 避开引物自身形成二级结构。
5. 选择Tm温度相互接近的二条引物。

Q-2:
PCR用引物的Tm值的计算方法?

A-2:
引物为20 mer以下时：
Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C)
引物为20 mer以上时：
Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L
其中L为引物的长度。
在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为 (Tm - 5)℃。

Q-3:
PCR用引物中含有Inosine (次黄苷) 碱基，其Tm值怎样计算?

A-3:
可以不考虑Inosine碱基，使用A、G、C、T计算Tm值就可以。

Q-4:
PCR用引物的使用量?

A-4:
合适的终浓度可在0.1 μM ~ 1.0 μM之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等) 作模板时，引物浓度应高一些。

Q-5:
简并性引物对PCR扩增有无影响?

A-5:
有影响。简并数量应尽量少。
通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。

Q-6:
50 μl PCR反应体系中Template的加入量?

A-6:
50 μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量：

人基因组DNA	0.1 μg ~ 1 μg
大肠杆菌基因组DNA	10 ng ~ 100 ng
λ DNA	0.5 ng ~ 5 ng
质粒DNA	0.1 ng ~ 10 ng

Q-7:
使用TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA Taq、SpeedSTAR HS进行PCR扩增后的PCRsofa评分产物可否进行TA克隆?

A-7:
可以。根据本公司的实验数据，以上三种PCR用DNA Polymerase的PCR扩增产物和TaKaRa Taq 一样，在DNA片段的3′端有一个附加的"A" 碱基 (A Overhang)，可以进行TA克隆。

Q-8:
PCR产物 (3′端附有A碱基时) 经末端平滑后，克隆于去磷酸的平滑末端载体时，其PCR产物需不需要5′末端磷酸化?

A-8:
需要。一般的PCR用引物5′末端都不带磷 (除非在引物合成时已特别标记)。使用这种引物进行PCR的PCR产物经末端平滑化后，与去磷酸的平滑末端载体连接之前，PCR产物必须进行5′末端磷酸化。

Q-9:
TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 有什么区别?

A-9:
TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 都具有3′→5′的Exonuclease活性，但这种活性TaKaRa LA Taq 强于TaKaRa Ex Taq。因此，TaKaRa LA Taq 的可信度强于TaKaRa Ex Taq，因而适合于进行Long PCR。一般来说，在扩增数kbp的DNA片段时，从灵敏度、扩增量、PCR条件的通用性等方面综合考虑，使用TaKaRa Ex Taq 较佳；而扩增15 kbp以上的DNA片段时，使用TaKaRa LA Taq 更好。

Q-10:
PCR产物需用限制酶进行消化时，需不需要进行Buffer交换?

A-10:
在通常情况下，首先须把PCR产物进行纯化后再进行限制酶的酶切反应。但如果只使用PCR反应液的一部分 (1~5 μl) 进行酶切反应时，可以不经纯化使用TaKaRa限制酶进行20 μl体系的酶切反应。

Q-11:
进行LA PCR时，为什么推荐使用2阶段温度PCR法?

A-11:
Long PCR成功的关键之一是设计30 mer以上的长引物，以增加引物的特异性。而长引物的Tm值一般较高，在进行PCR反应时，Annealing温度和Extension温度间的差距较小。当Annealing温度超过60℃时，Annealing温度和Extension温度就可以设定在同一数值，此时进行2阶段温度PCR反应，效果颇佳。
当使用20 mer左右的引物进行Long PCR时，进行3阶段温度PCR反应较好, 20 mer左右的引物也在诸多实验中成功地进行过Long PCR。

Q-12:
TaKaRa LA Taq with GC Buffer的Buffer使用方法如何?

A-12:
TaKaRa LA Taq with GC Buffer的制品包装中添附有GC Buffer I 和GC Buffer II。其中GC Buffer II 的DNA变性效果强于GC Buffer I，因此，在实验时可先使用GC Buffer I，当使用GC Buffer I 不能进行PCR扩增时再使用GC Buffer II。

Q-13:
使用TaKaRa LA Taq with GC Buffer扩增GC rich模板时应注意些什么?

A-13:
应注意使用Tm值较高的引物，因此，引物最好设计在30 mer以上。

Q-14:
TaKaRa LA Taq with GC Buffer可以扩增多长的GC rich模板?

A-14:
TaKaRa 公司曾经扩增过2 kbp的GC含量在70%的DNA模板。同时也可应用于200 bp~300 bp的短链DNA GC rich模板。

Q-15:
TaKaRa LA Taq with GC Buffer可否使用其GC Buffer扩增非GC rich的DNA模板?

A-15:
TaKaRa公司曾用GC Buffer I 成功地扩增了人基因组DNA 17.5 kbp的DNA片段 (GC含量50%) 和λ DNA 35 kbp的DNA片段。但由于GC Buffer和一般的PCR用Buffer相比DNA变性效果较强 (特别是GC Buffer II)。因此，一般的DNA模板使用GC Buffer进行PCR扩增时，有时会降低PCR扩增效率。

Q-16:
TaKaRa LA Taq 是否只可以扩增长片段DNA?

A-16:
不是，TaKaRa LA Taq 酶进行短片段DNA扩增时，其扩增性能仍然很好。如果常规PCR难以进行扩增时，可以尝试使用TaKaRa Ex Taq 酶、TaKaRa LA Taq 酶等，有时会得到非常好的结果。

Q-17:
使用Pyrobest DNA Polymerase进行PCR反应时的注意点?

A-17:
1. 在配制反应液时，请在加入dNTP Mixture后再加入Pyrobest DNA Polymerase。因为本酶的3′→5′ Exonuclease活性较强，反应液中如果不含dNTP，反应液中的引物有可能被分解。
2. PCR反应液请在冰中配制，并在配制后尽快进行反应。

Q-18:泥浆固液分离
使用Pyrobest DNA Polymerase进行PCR扩增后的PCR产物可否直接进行TA克隆?

A-18:
不可以。使用Pyrobest DNA Polymerase进行PCR扩增后的PCR产物3′端不附加 "A" 碱基，大部分为平滑末端。如果把使用本酶扩增的PCR产物克隆于去磷酸的平滑末端载体时，PCR产物必须进行5′末端磷酸化 (引物在合成时已进行5′末端磷酸化除外)。

Q-19:
Pyrobest DNA Polymerase的PCR扩增的可信度 (Fidelity) 是通常的Taq DNA Polymerase的几倍?

A-19:
根据TaKaRa公司的实验结果，Pyrobest DNA Polymerase的PCR扩增的可信度是通常的Taq DNA Polymerase的10倍。

gps监控

Q-20:
Pyrobest DNA Polymerase可以扩增多长的DNA片段?

A-20:
根据TaKaRa公司的实验结果，使用Pyrobest DNA Polymerase成功地扩增了5 kbp 的人染体DNA片段和12 kbp的λ DNA片段。

Q-21:
电泳时出现Smear，为什么?

A-21:

原因	建议
酶量过多	0.5 U间隔递减文学技巧
变性时间过短	变性时间5 sec间隔递增
变性温度过低	变性温度0.5℃间隔递增
dNTP量过少	50 μM间隔递增
Extension甲状腺鳞状细胞癌时间过长	1 min间隔递减
循环次数过多	2个循环间隔递减
Template量过多	Template量20%间隔递减

Q-22:
PCR产物中出现很多非特异性DNA带，为什么?

A-22:
可能有以下原因

原因	建议
Primer浓度过高	0.1 μM间隔递减
Primer的设计不合理	改变Primer的位置，增强特异性。设计Primer长度为30~ 35 mer，增强特异性。
酶量过多	0.5 U间隔递减
循环次数过多	2个循环间隔递减
Anneal温度过低	2℃间隔递增
从室温上升至变性温度 (94 ~98℃) 过程中引起的 Primer非特异性Annealing	采用Hot start法或Cool start法
Extension时间过短	1 min间隔递增
Template量过多	Template量20%递减