抗氧化活性研究
于丽娜1，杨庆利1,*，毕 洁1，张初署1，朱 凤1，禹山林1，杜方岭2
(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100；2.山东省农副产品加工研究所，山东 济南 250100)
摘 要：以花生壳为原料，经粉碎过筛后，采用一次酸提、二次酸提、三次酸提、微波提取和超声波提取等方法提取其中的功能性成分之一——水溶性膳食纤维(SDF)，测定每种方法的提取率和所得到的SDF 中的非淀粉性多糖(NSP)的含量，并计算它们的综合评分。结果表明：在这五种提取方法中，三次酸提的提取率最大，微波提取的SDF 中NSP 的百分含量最大，综合评分是三次酸提最大。同时，还研究了SDF 的铁还原力、钼还原力、清除DPPH 自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基等五种抗氧化活性。关键词：花生壳；水溶性膳食纤维；提取工艺；抗氧化活性 Extraction and Antioxidant Activity Evaluation of Water Soluble Dietary Fiber from Peanut Hull
YU Li-na 1，YANG Qing-li 1,*，BI Jie 1，ZHANG Chu-shu 1，ZHU Feng 1，YU Shan-lin 1，DU Fang-ling 2
(1. Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China ；
2. Shandong Agricultural Byproducts Processing Research Institute, Jinan 250100, China)
Abstract ：Water soluble dietary fiber (SDF) is one of the main functional components in peanut hull. In order to obtain this component, one-stage, two-stage and three-stage extraction using citric acid alone, microwave-assisted extraction and ultrasonic extraction were adopted and their effectiveness was comprehensively assessed in terms of two indicators, including SDF extraction yield and non-starch polysaccharide (NSP) content in SDF. Results showed that among these extractions, three-stage extraction presented the highest SDF extraction yield and the largest weighed score of the above indicators, and obtained using microwave-assisted extraction exhibited the highest NSP content in SDF. In addition, SDF was found to have significant radical scavenging capacity against hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals and excellent ferric-reducing power and molyb-denum-reducing power.
Key words ：peanut hull ；water soluble dietary fiber ；extraction ；antioxidant activity
中图分类号：TS255.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)22-0027-06
收稿日期：2009-06-15
基金项目：国家“863”计划项目(2007AA10Z189；2006AA10A114)；
“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAD97B04)；现代农业产业技术体系专项资金资助项目(nycytx-19)； 农业部农业公益性行业科研专项项目(nyhyzx07-014)
作者简介：于丽娜(1974－)，女，助理研究员，博士，研究方向为花生功能保健食品的开发与应用。 E-mail ：lhtyln0626@yahoo
*通讯作者：杨庆利(1977－)，男，副研究员，博士，研究方向为花生功能食品。E-mail ：rice407@sohu
膳食纤维指食物中不能被人体内源酶消化吸收的植物细胞、多糖、木质素以及其他物质的总和，这一定义包括食物中大量组成成分如纤维素、半纤维素、木质素、胶质、改性纤维素、黏质、寡糖、果胶以及其他少量组成成分如蜡质、角质、软木质[1]。一般来说，膳食纤维可按溶解性分为水溶性膳食纤维(w a t e r soluble dietary fiber ，SDF)和不溶性膳食纤维(insoluble
dietary fiber ，IDF)两大类[2]。膳食纤维不具有营养价值，但能和预防许多现代文明病，如心血管疾病、肥胖症、Ⅱ型糖尿病和一些癌症，对人体的正常代谢是必不可少的[3-6]。因此，建议成人每天摄入总的DF 为35g [7]，其中，SDF 大约占20%，IDF 占80%。但是，随着人们生活水平的提高，DF 的摄入量远远低于这个建议量，尤其S D F 的摄入量远远不够。
我国是世界花生生产、消费和出口大国，花生总产量和出口量均居世界前列。花生收获和加工时会产生大量的花生壳等副产品，花生壳富含粗纤维，是天然膳食纤维很好的来源。本实验以柠檬酸溶液为提取剂，采用一次酸提、二次酸提、三次酸提、微波和超声波等方法提取花生壳中的SDF，并研究SDF的抗氧化活性，旨在促进花生加工副产品的高值化利用。
１材料与方法
1.1材料与试剂
花生壳(2008年秋天收获的品种为花育19的花生果的外壳，去除霉烂、虫害的花生壳后，用自来水洗净，恒温干燥箱中80℃烘干，在植物粉碎机中粉碎，再经50目筛分，取筛下物作为提取SDF的原料) 山东省花生研究所莱西试验站。
柠檬酸、无水乙醇、木糖、半乳糖醛酸、苯酚、咔唑、硫酸、3,5-二羟基甲苯、三氯化铁、铁、三、磷酸三钠、钼酸铵、过硫酸铵、N,N,N',N'-四甲基二乙胺(TEM ED)、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸均为分析纯国产试剂；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH) 进口分装试剂；标准葡萄糖(标准品) Sigma公司。
1.2仪器与设备
植物粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；恒温干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温水浴振荡器金坛市杰瑞尔电器有限公司；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；微波炉广东格兰仕集团有限公司；真空旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂。
1.3方法
1.3.1SDF的提取
1.3.1.1一次酸提法
取一定量的花生壳粉原料，加入3%的柠檬酸溶液，在90℃恒温水浴中振荡提取2h。水浴结束后，反应器中的提取混合物经抽滤得到红棕提取液。该提取液经真空旋转蒸发得到浓缩液，在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀过夜。无水乙醇沉淀的混合液抽滤，滤渣在60℃干燥，粉碎后即得到一次酸提法的SDF 样品，简称S D F1。
1.3.1.2二次酸提法
取一定量的花生壳粉原料，加入3%的柠檬酸溶液，在90℃恒温水浴中振荡提取2h。水浴结束后，反应器中的提取混合物抽滤，保留滤液。抽滤后的滤渣加入柠檬酸溶液，与花生壳粉原料做同样处理后抽滤，滤液与第一次滤液合并为提取液。该提取液经真空旋转蒸发得到浓缩液，在浓缩液中加入4倍
体积的无水乙醇，沉淀过夜。无水乙醇沉淀的混合液抽滤，滤渣在60℃干燥，粉碎后即得到二次酸提法的SDF样品，简称S D F2。
1.3.1.3三次酸提法
取一定量的花生壳粉原料，加入3%的柠檬酸溶液，在90℃恒温水浴中振荡提取2h。水浴结束后，反应器中的提取混合物抽滤，保留滤液。抽滤后的滤渣加入柠檬酸溶液，与花生壳粉原料做两次相同的处理，合并三次滤液为提取液。该提取液经真空旋转蒸发得到浓缩液，在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀过夜。无水乙醇沉淀的混合液抽滤，滤渣在60℃干燥，粉碎后即得到三次酸提法的SDF样品，简称SDF3。1.3.1.4微波提取法
取一定量的花生壳粉原料，加入3%的柠檬酸溶液，在90℃恒温水浴中振荡提取20min，再微波处理(0.5min×5次)，水浴和微波交替处理三次共67.5min，反应器中的提取混合物抽滤，保留滤液。抽滤后的滤渣加入柠檬酸溶液后，同花生壳粉原料一样用水浴和微波交替处理三次，抽滤，合并两次抽滤液为提取液。该提取液经真空旋转蒸发得到浓缩液，在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀过夜。无水乙醇沉淀的混合液抽滤，滤渣在60℃干燥，粉碎后即得到微波提取法的SD F样品，简称SD F4。
1.3.1.5超声波提取法
取一定量的花生壳粉原料，加入3%的柠檬酸溶液，在90℃恒温水浴中振荡提取15min，再超声处理15min(超声频率为40kHz，超声波功率为150W，常温)，水浴和超声交替处理四次共2h，反应器中的提取混合物抽滤，保留滤液。抽滤后的滤渣加入柠檬酸溶液后，同花生壳粉原料一样用水浴和超声交替处理四次，抽滤，合并两次抽滤液为提取液。该提取液经真空旋转蒸发得到浓缩液，在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀过夜。无水乙醇沉淀的混合液抽滤，滤渣在60℃干燥，粉碎后即得到超声提取法的SDF样品，简称S D F5。
1.3.2评价指标综合评分的确定
评价指标综合评分由提取率和非淀粉性多糖(non-starch polysaccharides，NSP)百分含量两项评价指标的结果所组成，采取100分制[8]。考虑它们的重要程度，取权重比为提取率:NSP百分含量为1:2。
NSP百分含量×2+提取率
综合评分=————————————×100
3
M2
NSP百分含量(%)=——×100
M1
式中：M 2为产品所含NSP 质量(g)；M 1为SDF 产品质量(g )。
M 1
提取率(%)=——×100
M
式中：M 1为SDF 产品质量(g)；M 为花生壳原料质量(g )。1.3.3
SDF 产品中NSP 的测定
NSP 的测定应用目前公认的准确度高、重现性好的Englyst 法的基本原理。首先用酸将SDF 产品水解，然后水解液用分光光度法分别测定己糖[9]、戊糖[10]、糖醛酸[11]含量。根据SDF 中各种单糖的丰度，选择葡萄糖和木糖分别作为己糖和戊糖的标准物，半乳糖醛酸作为糖醛酸的标准物。采用苯酚-硫酸法测定己糖含量，地衣酚比法测定戊糖含量，咔唑-硫酸比法测定糖醛酸含量，最后通过转换系数得到N SP 含量。
根据己糖、戊糖、糖醛酸含量可计算出NSP 含量。计算公式如下[12]：
NSP 含量=己糖含量×0.9+戊糖含量×0.88+糖醛酸含量×0.811.3.4
SDF 抗氧化活性实验
1.3.4.1铁还原力实验[13]
1.0ml 样品液加0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.6)和1%的K 3Fe(CN)6溶液各1.0ml ，混合均匀，50℃水浴20min ，加入1.0ml 的10%三溶液，混合均匀，静置10min ，加
2.0ml 蒸馏水和1.0ml 0.1% FeCl 3溶液，混合均匀，静置10min 。在700nm 波长处测定样品液的吸光度。1.
3.
4.2
钼还原力实验[13]
1.0ml 样品液加入4.0ml 磷钼蓝试剂，混合均匀，在95℃水浴90min ，冷却后在695nm 处测定样品液的吸光度。1.3.4.3
清除DPPH 自由基实验[14]
吸光度DPPH(ml)
SDF(ml)95%乙醇(ml)
H 2O(ml)A 1 4.0 4.0－－A 2－ 4.0 4.0－A 3
对数螺线4.0
－
－
4.0
表１ 清除ＤＰＰＨ自由基实验表
Table 1 Reagent composition for DPPH free radical scavenging
assay
注：“－”表示实验时不加入该试剂。下同。
1.3.4.4
清除超氧阴离子自由基实验[14]
取三支试管按照表2加入过硫酸铵、T E M E D 、SDF 、盐酸羟胺等试剂，混合均匀后，在25℃水浴中恒温反应60min ，然后，在各试管中再加入对氨基苯磺酸和α-萘胺，混合均匀后，在室温下静置20min ，以蒸馏水为参比，在530nm 波长处测量吸光度，按下式计算清除率。
钠>苏格兰风情A 1－A 2
清除率(%)=(1－—————)×100
A 3
吸光过硫酸TEMED SDF 盐酸羟胺蒸馏水对氨基苯α-萘胺度铵(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)磺酸(ml)(ml)A 1 2.0 2.0 2.0 2.0－ 1.0 1.0A 2 2.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0－A 3
2.0
2.0
－
2.0
2.0
1.0
1.0
表２ 清除超氧阴离子自由基实验表
Table 2 Reagent composition for superoxide anion free radical
scavenging assay
1.3.4.5清除羟自由基实验[14]
取三支试管按照表3加入FeSO 4、SDF 和H 2O 2等试剂，混合均匀后，在室温下静置10m i n ，然后
向三支试管分别加入水杨酸-乙醇，混合均匀后在室温下静置30min ，以蒸馏水为参比，在510nm 波长处测量吸光度，按照下式计算清除率。
A 1－A 2
清除率(%)=(1－—————)×100
A 3
吸光度FeSO 4(ml)
SDF(ml)H 2O(ml)H 2O 2(ml)水杨酸-乙醇(ml)A 1 2.0 2.0－ 2.0 2.0A 2 2.0 2.0 2.0 2.0－A 3
2.0
－
2.0
2.0
2.0
表３ 清除羟自由基实验表
Table 3 Reagent composition for hydroxyl free radical scaveng-ing assay
２结果与分析
2.1
不同提取方法对花生壳SDF 提取的影响
NSP 是SDF 产品的主要活性成分之一，它的含量多
少关系到SDF 保健功能的大小[15]。因而，有必要确定
出SDF 产品中NSP 的含量，为以后SDF 产品的纯化和生理活性研究提供依据。本实验以SD F 的得率、NSP 百分含量以及综合评分为考察指标，研究了不同提取方法对花生壳SDF 提取的影响。2.1.1
提取次数
花生壳粉原料经柠檬酸溶液一次、二次和三次提取
取三支试管按照表1加入试剂，混合均匀后，在25℃水浴中反应30min ，以蒸馏水为参比，在517nm 波长处测定吸光度按下式计算清除率。
A 1－A 2
清除率(%)=(1－—————)×100
A 3
后，所得到的SDF 产品的得率逐渐增加(图1)。其中，二次提取SDF 的得率明显高于一次提取，说明多次提取有助于提高SDF 的得率。但是，三次提取SDF 的得率与二次提取的得率比较没有高出很多，则用柠檬酸溶液制备花生壳SDF 进行三次提取就能满足提取的需要，没有必要再增加提取次数。NSP 的百分含量随着提取次数的增加而增加(图1)，且三次提取得到的SDF 中NSP 百分含量远高于一次和二次提取的SDF 中NSP 百分含量。柠檬酸溶液提取SDF 的同时会将花生壳中的一些可溶性物质如水溶性蛋白质等物质提取出来。随着提取次数的增加，SDF 中NSP 的含量也明显增加，则表明花生壳中的可溶性物质被提取出来的量是一定的，增加提取次数有助于SDF 中有效成分的提取。由图1中综合评分曲线可以看出，用柠檬酸溶液提取花生壳SDF 的三次提取的综合评分最高，因此，可以确定三次提取为柠檬酸溶液提取花生壳SDF 的提取次数。
2.1.2
微波提取法
微波提取法具有节能、省时、环保、操作便利等优点，因此，它可与热水溶剂法结合来提取花生壳SDF 。从图1中可知，微波提取法的SDF 得率略小于三次提取的SDF 得率。可能原因是，在微波提取过程中产生了爆沸现象，损失了一小部分反应物，所以得率减小。但是，微波提取的SDF 中NSP 的百分含量要大于用柠檬酸溶液三次提取的SDF 中的NSP 含量。花生壳粉原料吸收了微波能，花生壳的细胞内部的温度就迅速上升，而花生壳的各个成分吸收微波的能力是不同的，可能花生壳的纤维素、半纤维素和果胶等粗纤维成分被选择性加热，这样它们就容易水解成低聚寡糖而溶于柠檬酸溶液中，则提取出来的SDF 中就含有较多的NSP 。而热柠檬酸溶液提取法中，热量传递是以热传导方式自外向内的传递，加热不均匀，导致粗纤维成分水解没有微波加热多，则柠檬酸溶液三次提取的SDF 中NSP 含量没有微波提取法多。2.1.3
超声提取法
超声提取法同样具有省时、节能、环保等特点，
它也可以与热水溶剂法结合来提取花生壳SDF 。超声波提取SDF 主要是利用超声波空化效应和超声机械作用。当用超声波处理反应液时，超声波作用在柠檬酸溶液里，当液体处于稀疏状态下时，液体会被撕裂成很多小的空穴，这些空穴在超声波纵向传播形成的负压区产生、生长，而在正压区迅速闭
合，闭合时产生瞬间高压，就会使粗纤维等成分的分子链断裂生成低聚寡糖。在超声的机械作用中，超声波的辐射压给予柠檬酸溶液和花生壳粉原料不同的加速度，从而在它们之间产生摩擦，也会使粗纤维等成分的分子链断裂，则SDF 等成分溶解在柠檬酸溶液中。因此，超声作用有助于花生壳中SD F 的提取。2.2
SDF 的抗氧化活性
氧自由基包括O 2・、・O H 、・O R 等，是人体正常代谢的产物，在正常情况下，体内氧自由基的产生和清除是平衡的。一旦体内氧自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，氧自由基代谢就会失衡，成为引起衰老和许多疾病的重要因素，例如癌症、心脏病、老年痴呆症等都与氧自由基有关。SDF 能减少血浆中低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的含量，促进肠道中益生菌生长繁殖，可作为预防、减轻症状、辅助心血管等疾病的功能性食品，可推断出SDF 有清除自由基等抗氧化活性。因此，应用S D F 做了铁还原力、钼还原力、清除DPPH 自由基、清除超氧阴离子自由基和清除羟自由基等五个体外抗氧化活性实验。2.2.1
SDF 铁还原力
图１ 不同提取方法对ＳＤＦ提取的影响
河北体育学院学报
Fig.1 Comparisons of extraction methods for SDF in SDF extraction yield and NSP content in SDF and their weighed score
5045403530
25
20151050
NSP 百分含量得率综合得分综合得分(分)
得率(%)N S P 百分含量(%)
一次提取二次提取三次提取微波提取超声提取图２ 铁还原力实验结果
Fig.2 Comparison of ferric-reducing power of SDF obtained by
different methods
0.300.250.200.150.100.050吸光度
SDF 1
SDF 2
SDF 3
SDF 4
SDF 5
还原力[13]是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而使自由基变为稳定的分子，从而失去活性。SD F 作为抗氧化剂具有给出电子的能力，它们的抗氧化效果与还原力密切相关，还原力越强，抗氧化性就越强。铁还原力实验是以Fe 3+→Fe 2+转化为原理，通过测定反应混合物700nm 处吸光度来评价化合物的还原力，吸光度越大，还原力越强。由图2可知，五种样品的吸光度在0.199～0.269之间，说明五种样品均具有铁还原力，这是因为SD F 中活性成分之一的N SP 为含有醇羟基的低聚糖类化合
物，具有给出电子能力。其中SDF 1、SDF 3和SDF 4的铁还原力要比其他两种样品的还原力大一些。2.2.2
SDF 钼还原力
钼还原力实验是基于抗氧化剂化合物将Mo(Ⅵ)还原为Mo(Ⅴ)，形成绿的Mo(Ⅴ)配合物，其在695nm 有最大吸收。抗氧化剂通过给予氢原子阻断自由基链反应。实验结果显示(图3)，反应结束后，五种样品的吸光度均在0.311～0.350之间，且SDF 1、SDF 3和SDF 4的吸光度大于其他两种样品的吸光度，说明SDF 1、SDF 3和SDF 4的钼还原力大一些。
2.2.3
SDF 清除DPPH 自由基
D PP H 自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由
基，若受试物能够清除它，则表示受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或者过氧自由基的有效浓度或打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH 自由基乙醇溶液为深紫，在517nm 附近有强吸收峰。当DPPH 自由基溶液加入自由基清除剂时，DPPH 自由基接受受试物的电子而变成稳定的抗磁分子，溶液颜由紫变成黄，吸光度变小。因此，可用来检测D PPH 自由基的清除情况，清除率越大，抗氧化性越强。由图4可知，五种样品都有清除DPPH 自由基的能力，其中SDF 3的清除DPPH 自由基效果最大。
发生化学变化对人体无害，但与羟基结合后的产物会导致细胞D N A 损坏，破坏人类机体功能，产生各种疾病。反应体系中，过硫酸铵与N ,N ,N ',N '-四甲基二乙胺(TEMED)产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与盐酸羟胺反应生成亚硝基，亚硝基经显反应后在530nm 有吸收峰。当体系中加入自由基清除剂后，则生成的有物质减少，吸光度减小，可判断对超氧阴离子自由基的清除效果，清除率越大则抗氧化活性越大。图5为5种样品清除超氧阴离子自由基实验结果。由图5以看出，5种样品都有清除超氧阴离子自由基的作用，其中，S D F 3的清除效果最好。
2.2.5
SDF 清除羟自由基
羟自由基(・OH) 是已知的最强的氧化剂，它反应性极强，寿命极短，几乎可以和所有细胞成分(氨基酸、蛋白质、核酸和脂肪)发生反应，造成生物机体损伤，导致衰老和疾病。F e n t o n 反应是生物体内产生・OH 的主要反应，其反应式可表示为：Fe 2++H 2O 2→Fe 3++OH －+・OH 。用比分析法测定Fenton 反应体系产生的・O H ，如果向反应中加入・O H 的清除剂，则・O H 减少，同时F e 2+增多，由此可推算・O H 的清除剂对・OH 的清除效果。5种样品对羟自由基的清除效果见图6所示，它们的清除率均在95%以上，说明五种样品对羟自由基的清除效果都很好，其中，SDF 5的羟自由基清除率最大。
图３ 钼还原力实验结果
Fig.3 Comparison of molybdenum-reducing power of SDF
obtained by different
methods
0.360.350.340.330.320.310.300.29吸光度
SDF 1
SDF 2SDF 3SDF 4SDF 5中兴u720
图５ 清除超氧阴离子自由基实验结果
Fig.5 Comparison of superoxide anion free radical scavenging
activity of SDF obtained by different
methods
6050403020100清除率(%)
SDF 1
SDF 2
SDF 3
SDF 4
SDF 5
图４ 清除ＤＰＰＨ自由基实验结果
Fig.4 Comparison of DPPH free radical scavenging activity of
SDF obtained by different
methods
80706050403020100清除率(%)
SDF 1
SDF 2SDF 3SDF 4SDF 5
2.2.4SDF 清除超氧阴离子自由基
超氧阴离子自由基在人体内有一定数量的存在，不
图６ 清除羟自由基实验结果
Fig.6 Comparison of hydroxyl free radical scavenging activity of
SDF obtained by different
methods
97.59796.59695.59594.594清除率(%)
SDF 1
SDF 2SDF 3SDF 4SDF 5
３结 论
采用柠檬酸溶液一次、二次、三次、微波和超声波提取花生壳中SDF，确定提取次数为三次即能满足柠檬酸水溶液提取的需要，微波和超声波有助于花生壳SDF的提取。SDF为NSP类低聚糖化合物，分子中含有醇羟基，测定了它们的铁还原力、钼还原力、清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基等五种抗氧化活性。结果显示，这些提取方法所提取出来的SDF 都有5种抗氧化活性，可以推断，SD F可以作为天然食品抗氧化剂或者作为预防剂用于功能食品中。花生壳是花生产业的副产品，从花生壳中提取SDF，可以提高花生壳的利用价值，增加花生产业的经济效益和社会效益。
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