1. 徐春兰,钦传光,尚晓娅,牛卫宁. Enterobacter CloacaeZ0206细菌胞外富硒多糖的抗氧化活性.化学研究，2010，21（2:）64-68.CHEMICAL RESEARCH 多糖是自然界中与人类生活紧密相关的一类天然生物高分子,具有免疫调节、抗氧化等多种生物学功能.国内外近年来对于多糖的抗氧化作用进行了广泛的研究[1,2],并有人据此解释了多糖抗衰老功效的药理机理.
1.3 E.cloacaeZ0206富硒多糖的制备
取出冷藏的E.cloacaeZ0206菌种,室温放置1 h后,在PDA培养基上2次活化后,接种到基础发酵培养基中进行试管发酵培养,30℃往复振荡培养,培养时间10 h,得到摇瓶发酵种子液. 2 000 mL摇瓶内加入500 mL基础发酵培养基,121℃蒸汽灭菌20 min,接种种子液,于摇床中30℃、220 r/min往复振荡培养,在培养的第6 h加入一定浓度的已过滤除菌的Na2SeO3溶液(使其终浓度为25 mg/L),发酵时间48 h,得到含有E.cloacaeZ0206富硒多糖的发酵液.发酵液于50℃浓缩为原体积的1/10, 90℃水浴1 h,5 000 r/min离心20 min,收集上清液,加入3~5倍体积预冷的95%乙醇,4℃静置24 h后, 5 000 r/min离心20 min,沉淀真空干燥,即得到粗多糖粉末.西游记金蝉脱壳
将其溶于适量蒸馏水,Sevag法除蛋白,反复进行多次至无蛋白层,然后用自来水和蒸馏水各透析24 h,透 析液中加无水乙醇,置4℃冰箱中醇沉过夜,再离心分离,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次,真空干燥,即得到E.cloacaeZ0206富硒多糖.E.cloacaeZ0206富硒多糖中多糖的测定采用苯酚-硫酸法,蛋白质含量的测定用考马斯亮蓝法,硒含量的测定采用紫外分光光度法. 准确地将E.cloacaeZ0206富硒多糖配成5.0 g/L,用超纯水将该溶液稀释成6种浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L.以维生素C(Vc)为对照品.称取20 mg的DPPH用无水乙醇溶解定容至500 mL.试验分为样品组和空白对照组:取2 mL 40 mg/L的DPPH溶液加入10 mL具塞的试管中,再加入2 mL样品溶液,空白对照组以超纯水代替样品溶液,充分混匀,室温下避光反应30 min后,在517 nm处测定吸光度.E.cloacaeZ0206富硒多糖清除DPPH自由基的能力由下式计算:DPPH自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%,式中A0为空白对照的平均吸光度值,A1为试样的平均吸光度值.
1.5 清除羟自由基试验
由Fenton法产生·OH.将E.cloacaeZ0206富硒多糖用双蒸水配制成质量浓度为5 g/L的多糖
溶液,并稀释成6个不同浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L.各取2 mL上述浓度的多糖溶液,依次加入6mmol/L的FeSO4溶液2 mL,混匀,6 mmol/L的H2O2溶液2 mL,混匀,静置30 min后于510 nm处测其吸光度值.空白对照组以双蒸水代替多糖溶液,以维生素C(Vc)做对照,临用前以双蒸水配制.羟自由基的清除率以下式计算:羟自由基清除率=(A0-A1)/A0×桥梁工程检测技术100%,式中A0为空白对照的平均吸光度值,A1为试样的平均吸光度值.
1.6 清除超氧阴离子自由基试验
采用邻苯三酚自氧化法产生O-2进行试验.将E.cloacaeZ0206富硒多糖用双蒸水配制成质量浓度为5g/L的多糖溶液,并稀释成6个不同浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L.取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)4.5 mL,广东茂名监狱惊天黑幕置于25℃水浴中预热25 min,分别加入1 mL不同浓度的多糖溶液和0.4 mL25 mmol/L邻苯三酚溶液,空白对照组以双蒸水代替多糖溶液,混匀后在25℃水浴中反应5 min,加入1
mL 8 mol/L的HCl终止反应,于299 nm处测吸光度.超氧阴离子的清除率以下式计算:超氧阴离子的清除率=(A0-A1)/A0×100%,式中A0贫富差距为空白对照的平均吸光度值,A1为试样的平均吸光度值.
1.7 还原能力的测定
将E.cloacaeZ0206富硒多糖用双蒸水配制成质量浓度为5 g/L的多糖溶液,并稀释成6个不同浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L,各取1 mL上述浓度的多糖溶液,加入pH 6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL、1%铁2.5 mL,混合均匀后于50℃水浴中保温20 min,再加入10%的三2.5 mL,混匀,以3 000 r/min离心10 min,移取上清液2.5 mL于试管中,加蒸馏水2.5 mL和0.1% FeCl30.5 mL,常温反应5 min后于700 nm处测定吸光度值,OD700 nm值越大说明测试样的还原能力越强,实验中选用Vc做对照.
2. 谢辉,李莉,吴鸣谦,陈双林*1株杜仲内生真菌的抗氧化活性分析和菌种鉴定. 安徽农业科学,Journal ofAnhui Agri.Sci.2009,37(1):230-232
Harper等的研究表明,植物内生真菌具有抗氧化活性或可产生天然的抗氧化活性产物[3-4]。而在杜仲内生真菌抗氧化活性的研究上,霍娟等应用TBA反应法对从杜仲叶片中分离到的内生真菌刺孢壳(Chaetomellasp.)培养液提取物进行了抗氧化活性的测定,发现该菌能够产生抗氧化活性成分,TLC和HPLC的分析表明活性成分为黄酮类化合物[5]. 利用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定菌株发酵液粗提物的总抗氧化活性,进行菌种筛选。菌株No.173表现
出最高的总抗氧化活性,达到20.70 U/ml,故选定其作为供试菌种.
1.2.1 杜仲内生真菌菌株No.173发酵液提取物的制备。采用马铃薯葡萄糖液体培养基为发酵培养基,250ml三角瓶装液量为100ml。挑取No.173少许菌丝接种于液体培养基中,(26±1)℃、100r/min培养7 d后过滤除去菌丝,滤液于(60±1)℃减压浓缩至黏稠状,加入适量无水乙醇(终浓度为85%),10 000r/min离心10 min,弃沉淀,上清液蒸去乙醇,上NKA-9大孔吸附树脂,80%乙醇洗脱,合并洗脱液,减压浓缩至黏稠状冷冻干燥,得到黄褐粉末状活性物质。
1.2.2 杜仲内生真菌菌株No.173发酵液提取物抗氧化能力测定[8]。精确称取相当于猪油质量的0.01%、0.02%、0.04%、0.06%的No.173菌株的发酵液提取物,分别放入锥形瓶中,加入少量超纯水溶解,同时以相应体积的超纯水代替样品作空白对照,以0.04%的Vc和0.04%的VE代替样品作阳性对照,再加入50.0 g猪油,搅拌均匀。将所有试样置于(60±1)℃烘箱中强化保存,每24 h搅拌1次,并测定其过氧化值(POV)。每组处理均设3个平行。过氧化值的测定按GB5009.37-2003滴定法进行[9]。
[3]HARPERJK,ARIFAM,FORDEJ,etal.Pestacin:A1,3-dihydro isobenzofu-ranfromPestaloti
opsismicrospora possessingantioxidant and antimycotic activi-ties[J].Tetrahedron,2003,59(14):2471-2476.
[4] LIUXL,DONGMS,CHENXH,etal.Antioxidant activity and phenolicsofan
Endophytic Xylari asp.fromGinkgo biloba[J].Food Chemistry,2007,105:548
-554.
[5]霍娟,陈双林.杜仲内生真菌抗氧化活性[J].南昌大学学报:理科版,2004,28(3):270-275.
[6]沈书庆,殷红,刘芸,等.产杜仲黄酮内生真菌的初步研究[J].菌物研究,2008,6(1):46-48.
3. 姜俊杰，邢莹莹，陆园园，奚 涛.北极放线菌 T-2-3 胞外多糖体外抗氧化作用研究. 药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology 2012，19( 4) : 313 ～ 316
生物体内源和外源性自由基均会导致生物体氧化损伤，从而诱发各种疾病( 癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、高血压等) 及促进衰老。为保护生物体，避免氧化损伤，寻外源性的自由基清除剂和抗氧化剂成为人们不懈的努力方向［1］。目前，多糖中研究得较为热门的
是植物多糖、海藻多糖和真菌多糖，而从细菌中、动物活体中提取多糖研究较少［2］.
1. 1 材料
1. 1. 1 北极放线菌 T-2-3 胞外多糖 ( Arctic Streptomyces sp. extracellular polysaccharide，ASEP) 为中国药科大学生物技术中心自制。T-2-3 是利用平板稀释法从北极黄河站附近海域潮间带的 9 个不同采样点的海泥样本中分离得到，原始菌株保藏于中国药科大学生物技术中心。经黄豆发酵液摇瓶发酵 7d 后，过滤收集发酵液，按醇沉法提取并经Sevage 法除蛋白，制备得到水溶性北极放线菌胞外多糖ASEP，经硫酸-苯酚法检测 ASEP 总糖含量 61. 7% 。ASEP经 DEAE-52 离子交换层析柱分离得到 ASEP-3，硫酸-苯酚法测定总糖含量为 99. 1%。
1. 1. 2 总还原能力测定试剂盒、超氧阴离子自由基( O－2) 、羟基自由基(·OH) 、H琼斯矩阵2O2和丙二醛( MDA) 测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所; VE( 1028 I. U/g) 、牛血清白蛋白: 购自 Sigma 公司。
1. 1. 3 ICR 小白鼠，清洁级，雄性，体重 20 ± 2 g，购自江苏省京青龙山养殖场。
1. 1. 4 主要仪器 玻璃组织匀浆器; UV-721 紫外可见分光光度计; 低温高速离心机; 恒温水浴锅。
1. 2 方法
1. 2. 1 总还原能力( T-AOC) 的测定 HTSS〗 参照总还原能力( T-AOC) 测试盒的方法，ASEP 或 ASEP-3 在反应体系中的终浓度分别为 0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 2，1. 4，1. 6 和1. 8 mg / mL，每个样品在 λ520处以蒸馏水为空白测定其吸光值，平行测定 3 次，取其平均值。
1. 2. 3 清除超氧阴离子自由基能力测定 参照抗超氧阴离子自由基测试盒的方法，ASEP 或 ASEP-3 在反应体系中的终浓度分别为 50，100，150，200 和 250μg/mL，每个样品在 λ546处以蒸馏水为空白测定其吸光值，平行测定 3 次，取其平均值。按下述公式计算超氧阴离子( O－·2) 清除率:O－·2清除率( %) = ( 1 － A分类号样品/ A
对照) ×100其中，A样品为加不同浓度的多糖实验组吸光度值，A对照为以等体积蒸馏水代替多糖溶液的对照组吸光度值。
1. 2. 4 清除羟自由基能力测定 参照羟自由基测试盒的方法，ASEP 或 ASEP-3 在反应体系中的终浓度分别为 50，100，150，200 和 250 μg / mL，每个样品在 λ542处以蒸馏水为空白测定其吸光度，平行测定 3 次，取其平均值。按下述公式计算羟自由基(·OH) 的清除率:·OH 清除率( %) = ( 1 － A样品/ A对照) ×100其中，A样品为加不同浓度的多糖实验组吸光度值，A对照为以等体积蒸馏水代替多糖溶液的对照组吸光度值。
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