多酚
精确称取没食子酸标准品25mg，用水溶解并定容至250ml，得对照品标准溶液。精密吸取对照品溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml于25m比瓶中，再加入1ml福林酚显剂，摇匀后再加入2ml 10% Na2CO3溶液，定容至10ml，室温下反应20min后测定A760.取一定量的香椿加蒸馏水碾碎，测其上清液测定。（根据吸光值自己调整量）
称取剪碎的香椿0.5g（按需称取），加入5 mL 80%乙醇研磨过滤，将滤液放置20 min。取0.1 mL滤液，加入5 mL水及0.5 mL福林酚反应8 min，再加1.5 mL 10%的碳酸钠溶液，于760 nm处测定吸光度值。根据标准曲线算出总酚含量。
黄酮
精确称取芦丁标准品10mg，加入几滴无水乙醇溶解，然后用60%乙醇定容至100ml，得对照品标准溶液。取芦丁标准液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80 和1.00 mL 分别放入1～6号25ml比管中，然后分别加入5ml蒸馏水，加入0.2mL 5%NaNO2，摇匀,静置6min ;再分别加入0.2mL 10%Al(NO3)3，摇匀，静置6min，再分别加入1mL 4%NaOH，用60%乙醇定容至刻度10ml处,摇匀，静置15min，然后于510nm下测吸光度。取一定量的香椿加60%乙醇碾碎，测其上清液测定。（根据吸光值自己调整量）
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【摘要】 目的 研究沙棘籽原花青素体外抗氧化活性。方法 DPPH法测定沙棘籽原花青素抗氧化、清除自由基能力。结果 沙棘籽原花青素抗氧化、清除自由基能力略低于抗坏血酸，清除DPPH 自由基的半数有效量分别为93.0g/kg和70.3g/kg，自由基清除能力分别为0.0107和0.0142。结论 沙棘籽原花青素具有抗氧化活性。
【关键词】 沙棘籽 原花青素 DPPH
沙棘是胡颓子科，多年落叶乔木或灌木，能防风固沙、保持水分、改良土壤，具有优异的生态效益［1］。主产于我国内蒙、宁夏、青海等地，不仅是西部生态治理的优选植物，而且具有很高的药用价值，被誉为“高原圣果”。近年来国内外根据沙棘果实的传统用药，将鲜果开发出沙棘果汁、沙棘口服液、沙棘油等产品，但是作为沙棘果实加工业副产品的沙棘籽，还没有被有效的开发利用。国内外研究表明不同沙棘籽提取物具有抗氧化作用，沙 棘籽总黄酮有直接捕获超氧自由基和羟自由基，清除大鼠体内自由基的作用［2-3］。而沙棘籽还富含原花青素［4］，原花青素(Proanthocyanidins)是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成的黄烷-3-醇衍生物的总称。目前对沙棘籽原花青素清除自由基的作用研究未见相关报道，为此本文对沙棘籽原花青素进行体外抗氧化作用的研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料 UV-2550紫外分光光度计(日本岛津)，FW110型高速粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，RE-F20旋转蒸发仪(长城亚荣生化仪器厂)，AE240十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒)；DPPH标准品(美国SIGMA公司)，抗坏血酸(分析纯，广州化学试剂厂，批号20061108-1)，儿茶素标准品中国人民解放军军语(中国药品生物制品检定所)，其余试剂均为分析纯。沙棘籽采自宁夏六盘山，经隆德县林业局鉴定为中国沙棘亚种(H.rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi)。
1.2 实验方法
1.2.1 DPPH法测定原花青素抗氧化、清除自由基的原理
二苯基苦味肼基自由基［DPPH·］是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517nm波长处有最大吸收。［DPPH·］乙醇溶液呈紫，其浓度与吸光度呈线性关系。在［DPPH·］乙醇溶液中加入原花青素后，原花青素可以与［DPPH·］结合或发生替代，使［DPPH·］数量减少，溶液颜变浅，表现为：其在517nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。因此，可以通过在517nm 波长处检测原花青素对［DPPH·］自由基的清除效果，计算其抗氧化能力。
1.2.2 DPPH标准曲线的制作
精密称定DPPH标准品9.06mg，乙醇定容至100mL，配制成质量浓度为90.6μg/mL的标准溶液，置4℃冰箱中保存备用。分别吸取1、1.5、2.5、5、10mL标准溶液，乙醇定容至慧美杂志10mL，517nm测其吸光度，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.0149C+0.0062，R2=0.9994
1.2.3 沙棘籽提取物的制备
将干燥的沙棘籽用高速粉碎机粉碎处理，过100目筛，称取适量，石油醚浸泡脱脂，晾干，85%丙酮提取，料液比为1∶4(m/v)，温度为30℃，回流提取14h后，冷却，抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩，得沙棘籽提取物干粉。
1.2.4 沙棘籽提取物中原花青素含量的测定［6］
取一定量沙棘籽提取物干粉，配制成0.287mg/mL沙棘籽提取物甲醇溶液，取1mL(另取1mL甲醇液为空白液)，加入显剂，30℃恒温水浴30min，500nm测其吸光度，根据儿茶素标准曲线测得沙棘籽提取物中原花青素的含量为76.52%。
1.2.5 自由基清除率测定实验［7］
精密称定0.0501g沙棘籽提取物，乙醇定容至100mL。分别配制浓度为0.0313、0.0625、0.125、0.250、0.501mg/mL乙醇溶液，作为实验组。同时配制等浓度梯度的抗坏血酸作为对照组。采用动力学监测法［8］，测定溶液随时间变化的吸光度A，每30s取值1次，待吸光度基本不变时，药物与自由基反应完全，记录最终吸光度。
自由基清除率(%)=1-Ai-AjAo×100
式中：Ａ0为未加药DPPH溶液的空白吸光度；Ａi为加药后DPPH溶液的吸光度；Ａj为样品溶液自身的吸光度。
1.2.6 清除自由基的半数有效量(EC50)的计算和自由基清除能力(AE)的评价
根据沙棘籽原花青素清除DPPH自由基的曲线，计算得到DPPH自由基原始质量浓度减少至50%(稳定态)时沙棘籽原花青素的用量为半数有效量(EC50)。自由基清除能力(AE)，AE=1/EC50，根据AE的大小判断抗氧化剂清除自由基的能力的大小。
2 结果
2.1 沙棘籽提取物吸光度-时间曲线及其自由基清除率
图1 沙棘籽提取物清除自由基的动力学监测图（略）
自由基溶液中加入各浓度沙棘籽提取物溶液0.5h(1800s)后，溶液的吸光度不再改变，反
应完全(图1)。记录0.5h时的测定值Ai和Aj(表1)。
表1 沙棘籽提取物对自由基的清除率（略）
2.2 抗坏血酸吸光度-时间曲线及其自由基清除率(%)
图2 抗坏血酸清除自由基的动力学监测图（略）
自由基溶液中加入各浓度抗坏血酸溶液0.5h(1800s)后，溶液的吸光度不再改变，反应完全(图2)。反应时间与样品组保持一致，同样记录0.5h时的测定值Ai和Aj(表2)。
表2 抗坏血酸对自由基的清除率（略）
2.3 实验组和对照组抗氧化活性对比
根据药物添加量与自由基清除率(%)的关系，制作二者的关系曲线，通过线性回归分析得到回归方程，利用SigmaPlot软件计算得出沙棘籽提取物清除异体蛋白DPPH自由基的EC50为93.0g/kg，AE为0.0107；抗坏血酸清除DPPH自由基的EC50为70.3g/kg，AE为0.0142
3 讨论
DPPH自由基法是判定药物体外抗氧化活性的经典实验方法。本研究结果表明沙棘籽提取物随着剂量的增加，DPPH自由基清除率相应增加，并成剂量依赖关系，提示反应初期原花青素与DPPH自由基结合生成DPPH-PheO，消耗DPPH，降低DPPH的含量，当沙棘籽提取物剂量达0.125mg/mL以上时，DPPH的含量不再出现相应的降低。其机制可能是当DPPH减少到一定程度，就会出现原花青素芳香环上的羟基和DPPH自由基相互竞争与PheO·结合生成PheO-PheO，从而抑制了原花青素与DPPH自由基的结合所致［9黄可龙］
本次实验结果表明，沙棘籽提取物对DPPH自由基具有清除作用。与相同浓度抗坏血酸的对比可知(图3)，沙棘籽提取物剂量在0.0625mg/mL以上时，清除DPPH自由基的能力与抗坏血酸相当。抗坏血酸的自由基清除率在1～2min之后即达到最大值(图2)，属快速抗氧化剂；沙棘籽原花青素提取物的自由基清除率在3～5min后达到最大值(图1)，属中速抗氧化剂。
本次实验结果提示，沙棘籽原花青素提取物能够清除DPPH自由基，具有抗氧化活性，可在提取及含量测定上更深入地进行研究，以达到开发新药的目的。
【参考文献】
［1］ 王中英.果树学概论［M］.北京：高等教育出版社，1993：191.
［2］ 曹华，瞿伟菁，黄晓青，等.沙棘籽渣和果渣中黄酮抗脂质过氧化［J］.中成药，2003，25(8)：670-673.
［3］ PS Negi，AS Chauhan，GA Sadia.不同沙棘籽提取物的抗氧化和抗菌活性研究［J］. 国际沙棘研究与开发，2006，4(1)：1-6.
［4］ 刘朵花，李伟，吴伸.沙棘和葡萄籽中原花青素的对比研究［J］.沙棘，2000，13(3)：35-38.
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2006，15(3)：204-207.
［6］ Brand-Williams W，Cuvelier ME，Berset C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity［J］.Lebensm Wiss Technol，1995，28(1)：25-30.
［7］ 李春阳，许时婴，王璋.低浓度香草醛—盐酸法测定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究［J］.食品工业科技分析检测，2004，25(6)：128-130．
［8］ 李小飞，张伟，薛淑媛，等.两种测试方法对DPPH分光光度法测试结果的影响［J］.生物技术，2007，17(4)：24-26.
［9］ 李春阳，许时婴，王璋.DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由基的能力［曾国荃J］.食品与生物技术学报，2006，25(2)：102-106.
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