李珊珊，王珊丹，燕洪涛，等．不同提取工艺对猴头菇多糖产率、单糖组成及ＤＰＰＨ清除活性的影响［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１１）：１５４－１５６．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１１．０４０ 不同提取工艺对猴头菇多糖产率、单糖组成
及ＤＰＰＨ清除活性的影响
菲奥娜李珊珊１，王珊丹２，燕洪涛３，陈建波１，孙印石１
（１．中国农业科学院特产研究所，吉林长春１３０１１２；２．吉林省人民医院，吉林长春１３００２１；３．吉林大学第二医院，吉林长春１３００４１） 摘要：采用热水提取、淀粉酶解、果胶酶解和超声４种方式对猴头菇多糖进行了提取，分别比较了不同提取方式所得到多糖的产率、总多糖含量、单糖组成及清除ＤＰＰＨ自由基活性方面的差异。结果发现，不同提取方式对多糖的产率、溶解性、葡萄糖和半乳糖的含量、ＤＰＰＨ清除活性均有影响，其中超声提取和酶解提取得到的多糖ＤＰＰＨ自由基清除活性优于热水煮提得到的猴头菇多糖。
关键词：猴头菇多糖；提取工艺；单糖组成；自由基
中图分类号：ＴＳ２４１；Ｒ２８４．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１１－０１５４－０２
收稿日期：２０１６－１２－０７
基金项目：吉林省科技发展计划医药产业发展引导资金（编号：２０１５０３１１０５５ＹＹ）。
作者简介：李珊珊（１９８４—），女，吉林四平人，博士，助理研究员，从事特种动植物功能成分的结构、活性及产品开发。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｓｈａｎｓｈａｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ。
通信作者：孙印石，博士，研究员，从事特种动植物加工研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｉｎｓｈｉ２００２＠１６３．ｃｏｍ。
猴头菇（Ｈｅｒｉｃｉｕｍｅｒｉｎａｃｅｕｓ）别称猴头菌、刺猬菌，属担子
菌纲多孔菌目齿菌科猴头属［
１］
。在我国多地均有分布，尤其在长白山脉资源丰富，是一种非常具有特的食用菌类。猴
头菇含有多种营养成分，如蛋白质、多糖、脂肪、氨基酸等［２］
。
多糖是猴头菇的重要活性成分，已被证实具有保护胃黏
膜［３］、增强免疫力［４－６］、抗肿瘤［７－９］、抗疲劳［１０］等多种功效。
关于猴头菇多糖的研究已经越来越受重视，但多以活性研究为主，提取方法和单糖组成研究较少，一定程度上限制了猴头菇多糖的应用。针对上述现状，以猴头菇为原料，分别比较了热水煮提、超声提取、果胶酶提取、淀粉酶提取５种提取方式对猴头菇多糖的产率、总多糖含量和单糖组成的影响。１ 材料与方法１．１ 材料与试剂
猴头菇采购于吉林省长春市立新参茸特产超市；果胶酶、淀粉酶采购于河南正兴食品添加剂有限公司；单糖标准品采购于Ｓ
ｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司；ＤＰＰＨ采购于Ｃｏｏｌａｂｅｒ公司（Ｃａｔ＃ＣＤ４８９１－５００ＭＧ）；其他试剂均为国产分析纯。１．２ 主要仪器
ＴＧＬ－１６Ａ高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；ＦＤ－１Ａ－５０低温冷冻干燥机，北京博
医康技术有限公司；超声波清洗机ＪＰ－１００ＳＴ，深圳市洁盟清洗设备有限公司；电热恒温水浴锅ＨＨＳ型，上海实业有限公司医疗设备厂。
高效液相谱仪及谱柱：紫外检测器，ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ，日本岛津仪器有限公司；溶剂输送泵，ＬＣ－１６，岛津仪器（苏州
城市的月光有限公司；柱温箱，ＣＴＯ－１６，岛津仪器（苏州）有限公司；谱柱，
ＯＤＳＨｙｐｅｒｓｉｌ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。１．３ 实验方法
分别采用热水煮提、超声提取、果胶酶解和淀粉酶解法对猴头菇多糖进行提取。
１．３．１ 热水煮提法 ５０ｇ干燥的猴头菇切成小块后加入１Ｌ蒸馏水，浸泡４ｈ，１００℃煮提２ｈ后过滤，滤渣重复提取２次。合并３次提取所得滤液，６０℃水浴浓缩至２００ｍＬ，离心（４５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），弃去沉淀。向上清液加入４倍量无水乙醇，沉淀过夜。离心（４５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），收集沉淀。向沉淀中加入１５０ｍＬ蒸馏水，充分溶解，重复醇沉１次。沉淀冷冻干燥，得猴头菇多糖ＷＨＰ。
１．３．２ 淀粉酶提取法 ５０ｇ干燥的猴头菇切成小块后加入１Ｌ蒸馏水，浸泡４ｈ，加入１ｇ
淀粉酶６０℃提取１ｈ后，煮沸１０ｍｉｎ对酶进行灭活，过滤，滤渣重复提取２次。合并３次提取所得滤液后，处理方式同热水煮提法，最终得到多糖ＷＨ
Ｐ－Ｄ。１．３．３ 果胶酶提取法 ５０ｇ干燥的猴头菇切成小块后加入１Ｌ蒸馏水，浸泡４ｈ，加入１ｇ果胶酶５５℃提取１ｈ后，煮沸１０ｍｉｎ对酶进行灭活，过滤，滤渣重复提取２次。合并３次提取所得滤液后，处理方式同热水煮提法，最终得到多糖ＷＨＰ－Ｇ。
１．３．４ 超声提取法 ５０ｇ干燥的猴头菇切成小块后加入１Ｌ蒸馏水，浸泡４ｈ，超声（３００Ｗ，４０℃）提取０．５ｈ后过滤，滤渣重复提取２次。合并３次提取所得滤液后处理方式同热水煮提法，最终得到多糖ＷＨＰ－Ｃ。
１．３．５ 理化性质测定 采用苯酚－硫酸法测定总糖含量。
单糖组成分析［１１－１３］
：称取多糖样品２ｍｇ，依次用１ｍｏｌ／Ｌ
盐酸－甲醇溶液和２Ｍ三氟乙酸溶液水解，ＰＭＰ衍生化后ＨＰＬＣ检测。采用ＳｈｉｍａｄｚｕＨＰＬＣ系统，ＨｙｐｅｒｔｓｉｌＯＤＳ谱柱，流动相为８２．０％ＰＢＳ（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值７．０）和１８．０％（体积分数）乙腈，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，进样量为２０μＬ，
检测
—４５１—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第１１期
波长为２４５ｎｍ。
１．３．６ 多糖的ＤＰＰＨ清除率检测 ＤＰＰＨ溶液的配制：５ｍｇＤＰＰＨ，加入无水乙醇定容至１００ｍＬ，充分溶解，避光保存。
取０．５ｍＬ样品溶液（空白对照为水），加入０．５ｍＬＤＰＰＨ溶液，避光反应１ｈ，５１７ｎｍ处测吸光值［１４］。
ＤＰＰＨ清除率＝（Ｄ
对照－Ｄ
样品
）／Ａ
对照
×１００％。
Ｄ
对照：空白对照管反应后的吸光值；Ｄ
孩子我为什么打你阅读答案样品
：样品溶液反应
后的吸光值。
２ 结果与分析
２．１ 不同方式提取得到的猴头菇多糖产率及单糖组成比较通过对不同提取方式得到的多糖产率及单糖组成进行对比（表１），可以发现，超声法产率最低，果胶酶解和淀粉酶解次之，煮提法产率最高。总糖含量相差不大。
猴头菇多糖主要由葡萄糖（Ｇｌｃ）、半乳糖（Ｇａｌ）、岩藻糖（Ｆｕｃ）和甘露糖（Ｍａｎ）组成。煮提得到的多糖含有８８．６％的Ｇｌｃ，超声后得到的多糖中Ｇｌｃ含量为４３．２％，果胶
酶解和淀粉酶解提取得到的多糖Ｇｌｃ含量分别为８６．８％和６４．３％。超声提取过程中，一些糖苷键被破坏，而使长链多糖成为短链寡聚片段，造成多糖提取效率较低，因此超声法提取效率较低。并且与煮提相比，超声提取法得到的多糖中Ｇａｌ和Ｆｕｃ的比例几乎没有变化，说明Ｇａｌ和Ｆｕｃ可能通过某些连接方式结合在一起，Ｇｌｃ含量的降低表明一些淀粉样的葡聚糖链被打断，成为寡聚片段在醇沉时被除去。
相比之下，果胶酶解法得到的多糖不论从产率上还是单糖组成上，都与煮提法得到的多糖差异不大。这是因为猴头菇多糖本身含有的半乳糖醛酸（ＧａｌＡ）量很低，几乎检测不出来，果胶酶失去了作用点，因此果胶酶提取法与煮提法相比没有太大的差异。
淀粉酶能够水解α－１，４－Ｇｌｃ和α－１，４－Ｇｌｃ之间的连接键，因此淀粉酶解后得到的多糖中Ｇｌｃ含量明显降低，Ｇａｌ含量升高。虽然一些淀粉样多糖被水解掉，但由于淀粉酶能够打断多糖通过Ｇｌｃ与细胞壁之间的连接，提高提取效率，所以整体产率并无太大变化。在试验中如果想要获得猴头菇多糖中的富含Ｇａｌ的级分，可以考虑用淀粉酶解法。
表１ 不同提取方式得到的多糖产率和单糖组成
样品名称提取方式产率
（％）
总糖含量
（％）
单糖组成（％）
ＧｌｃＧａｌＦｕｃＭａｎ
ＷＨＤ煮提 １１．９７１．４８８．６９．１２．２０ＷＨＤ－Ｄ淀粉酶解９．４６８．４６４．３２９．８５．９０ＷＨＤ－Ｇ果胶酶解９．５６９．２８６．８９．２２．３１．７ＷＨＤ－Ｃ超声 ４．４７２．７４３．２４５．７９．３１．８
２．２ 猴头菇多糖的抗氧化能力检测
ＤＰＰＨ自由基是一种物理性质稳定的有机自由基，溶于乙醇后呈紫红，在５１７ｎｍ处有最大吸收峰［１５］。当存在自由基清除剂时，紫红随反应逐渐变弱，褪程度与接受的单电子数呈正相关。反应过程中ＤＰＰＨ的清除率可反映样品清除自由基ＤＰＰＨ的能力。清除率越高，则样品的抗氧化活性越强。
不同提取方式得到的猴头菇多糖对ＤＰＰＨ的清除能力具有明显差异（图１）
。不同提取方式得到的猴头菇多糖都能一定程度上清除ＤＰＰＨ自由基，并具有一定的浓度依赖性。
水提多糖ＷＨＰ对ＤＰＰＨ的清除率较低。ＷＨＤ－Ｄ和ＷＨＤ－Ｐ差异不大，在浓度为１ｍｇ／ｍＬ时，清除率均能达到４０％以上。ＷＨＰ－Ｃ的浓度为１ｍｇ／ｍＬ时，清除率接近６０％。当多糖浓度小于等于０．８ｍｇ／ｍＬ时，ＷＨＰ－Ｄ对ＤＰＰＨ清除的效果最好；当多糖浓度大于０．８ｍｇ／ｍＬ时，ＷＨＰ－Ｃ对ＤＰＰＨ清除的效果最好。因此，如果想得到抗氧化活性好的猴头菇多糖，可以根据实际情况考虑利用淀粉酶解法或超声提取法。
３ 讨论与结论
本研究对猴头菇的提取工艺进行了比较，并通过ＤＰＰＨ自由基清除试验验证了其抗氧化活性。煮提和果胶酶解法提取得到的多糖单糖组成相似，但果胶酶解后得到的多糖水溶性更好。淀粉酶解得到的多糖中Ｇａｌ含量明显高于其他几组。而超声提取得到的多糖Ｇｌｃ和Ｇａｌ比例约为１∶１。通过热水煮提得到的多糖产率最高，但抗氧化活性不明显。淀粉酶解与果胶酶解得到的多糖产率相近，活性略有不同，低浓度时淀粉酶解多糖活性较好，高浓度时果胶酶解多糖活性更强。超声提取得到的多糖产率最低，当多糖浓度小于１ｍｇ／ｍＬ时抗氧化效果最好。这可能是与多糖的溶解度相关，不同提取方式得到的多糖溶解度排序为超声提取＞淀粉酶提取＞果胶酶提取＞水提多糖。当多糖浓度较低时，溶解性越好的多糖抗氧化活性越明显。本研究结果可以为猴头菇多糖的提取及活性评价提供一定的指导，也为猴头菇多糖的进一步研究奠定了基础。
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５
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櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
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陈 琛，李鑫鑫，付昀东，等．汉中天麻多糖抗菌活性研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１１）：１５６－１５９．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１１．０４１
汉中天麻多糖抗菌活性研究
陈 琛１，李鑫鑫１，付昀东１，刘 祥１，郑红星１，吴三桥１，李晓东２
（１．陕西理工大学中德天然产物研究所／陕西理工大学生物科学与工程学院／陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心／陕南秦巴山区
生物资源综合开发协同创新中心，陕西汉中７２３０００；２．陕西省略阳县中药材技术推广服务中心，陕西略阳７２４３００）
摘要：采集湿天麻，通过常压蒸煮、切片、烘干、粉碎、超声辅助水提醇沉、脱等工艺处理，得到天麻粗多糖。利用薄层平板琼脂糖孔穴扩散法定性测定天麻粗多糖抗菌活性，进而采用微量肉汤稀释法测定４０株菌株（包括标准株和临床分离株）的最小抑菌浓度（ｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，简称ＭＩＣ）。天麻多糖具有广谱抗菌活性，对Ｇ－的ＭＩＣ范围为０．４６８７５～１５ｍｇ／ｍＬ，对Ｇ＋的ＭＩＣ范围０．９３７５～１２０ｍｇ／ｍＬ，对真菌的ＭＩＣ范围０．９３７５～３０ｍｇ／ｍＬ，其中对嗜麦芽假单胞菌０９０２２３、黏质沙雷氏菌１３７９、产酸克伯杆菌３株菌的抑菌活性最好，ＭＩＣ为０．４６８７５ｍｇ／ｍＬ。汉中天麻多糖粗提物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌具有一定的抗菌活性。 关键词：天麻多糖；提取；抗菌活性；最小抑菌浓度
中图分类号：Ｑ９４９．９５；Ｒ２８５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１１－０１５６－０４
收稿日期：２０１７－１０－０６
基金项目：国家高端外国专家项目（编号：ＧＤＷ２０１４６１００２２８、ＧＤＴ２０１７６１０
００４８）；国家重点引智项目（编号：Ｗ２０１６６１０００４５）；陕西省科技统筹创新工程（编号：２０１５ＫＴＴＳＳＦ０１－０３、２０１５ＨＢＧＣ－１８
）；陕西省科技研究发展计划（编号：２０１５ＮＹ－０７０、２０１７ＮＹ－１８０）；陕西省教育厅科研项目（编号：１７ＪＫ０１３５）；陕西省协同创新计划（编号：２０１６ＸＴ－１３）；陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心项目［编号：ＱＢＸＴ－Ｚ（Ｐ）－１５－２１］。
作者简介：陈 琛（１９７８—），男，陕西宝鸡人，硕士，副教授，主要从事天然产物研究与开发。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｃｈｅｎ２００８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ。
通信作者：郑红星，博士，讲师，主要从事功能食品的研究与开发。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｈｏｎｇｘｉｎｇ１００＠１２６．ｃｏｍ。
天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ．）别称赤箭、定风草、水洋芋等，为兰科天麻属与密环菌特殊共生的多年生草本植物，属国家
三级保护物种，是一种名贵的中药材，药用部位为其块茎［１］，
其味甘、性平，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功能，用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等
荷香散尽病症［
彭真２］，同时具有镇静、催眠、镇痛、增强免疫等作用［３－９］
。天麻中主要含有天麻素、天麻苷元、天麻多糖等多种成分［１０－１１］
，其中天麻多糖含量高达２５％［１２］。
多糖是由１０个以上的单糖通过糖苷键连接而成的一种
天然大分子化合物，其种类繁多，广泛存在于动物、植物、微生物中，目前对植物多糖和微生物多糖的研究较多。大量研究表明，多糖具有多种药理活性，如增强机体免疫力、抗肿瘤、抗
病毒、抗氧化、降血糖、抗辐射和抗衰老等作用［
１３－１４］
。通过中国知网（ＣｈｉｎａＮａｔｉｏｎａｌＫｎｏｗｌｅｄｇｅＩｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，简称ＣＮＫＩ）和美国国立生物技术信息中心（
ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，简称
ＮＣＢＩ）检索发现，目前关于天麻多糖的研究主要集中在天麻多糖的提取工艺优化、天麻多糖的分离纯化、分子组成分析及结构表征、天麻多糖的增强免疫作用、改善睡眠等方面，未见有关天麻多糖的抗菌活性的研究报道。因此，本试验以汉中天麻为研究对象，从天麻块茎中提取多糖并研究抗菌活性，为其进一步开发研究提供理论依据。１ 材料与方法１．１ 供试药材
鲜天麻，２０１６年１１月采集于陕西省汉中市略阳县。１．２ 供试菌株
选取的４０株菌株中革兰氏阴性菌（Ｇ－）２０株、革兰氏阳性菌（Ｇ＋）１２株、真菌８株。４０株菌株中标准菌株库菌株２株，临床分离致病菌３８株。菌株由大连理工大学生命科学院于海宁教授、苏州大学药学院王义鹏副教授提供，具体见表１。
—６５１—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第１１期
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