山 东 化 工
收稿日期：２０１９－０５－１７
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费中国中医科学院基础所自主选题项目（ＹＺ－１６１４）作者简介：朱田密（１９８２—），女，硕士，副主任药师，主要从事中药资源及其品质研究。 朱田密１，２，陈树和１，２
，张金亮３，陈科力４
（１．湖北省中医院药事部，湖北武汉 ４３００６１；２．湖北省中医药研究院中药研究所，湖北武汉 ４３００７４；
３．武汉华夏理工学院生物与制药工程学院，湖北武汉 ４３０２２３；４．湖北中医药大学药学院，湖北武汉 ４３００６５）
摘要：研究石上柏中双黄酮类化合物的抗氧化活性。采用乙醇回流提取，聚酰胺柱谱和葡聚糖凝胶柱
谱纯化得到双黄酮类混合物结晶，利用液质联用法鉴定组成。采用ＤＰＰＨ自由基清除法测试其抗氧化活性，以抗坏血酸作为阳性对照。获得的石上柏双黄酮类混合物结晶由穗花杉双黄酮，罗波斯塔双黄酮，７－去甲基银杏双黄酮，罗波斯塔－４＇－甲醚，罗汉松双黄酮Ａ组成，在质量浓度５２．３μｇ／ｍＬ时，总双黄酮对ＤＰＰＨ自由基的清除率为８．０％，而抗坏血酸为９５．５％。石上柏中双黄酮类对ＤＰＰＨ自由基有一定的清除作用，相对于抗坏血酸较弱。关键词：石上柏；双黄酮；ＤＰＰＨ自由基；抗氧化；构效关系中图分类号：Ｒ２８４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０１９）１６－００１２－０２
ＳｔｕｄｙｏｎＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＢｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａｄｏｅｄｅｒｌｅｉｎｉｉ
ＨｉｅｒｏｎｏｎＳｃａｖｅｎｇｉｎｇＤＰＰＨＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌ
ＺｈｕＴｉａｎｍｉ１，２，ＣｈｅｎＳｈｕｈｅ１，２，ＺｈａｎｇＪｉｎｌｉａｎｇ３，ＣｈｅｎＫｅｌｉ
４（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ ４３００６１，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａｍｅｄｉｃａ
，ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ ４３００７４，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ＷｕｈａｎＨｕａｘｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３０２２３，Ｃｈｉｎａ；４．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ ４３００６５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｓｔｕｄｙａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｂｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａｄｏｅｄｅｒｌｅｉｎｉｉＨｉｅｒｏｎ．Ｅｔｈａｎｏｌｒｅｆｌｏｗｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，
ｐｏｌｙａｍｉｄｅｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｔｏａｂｔａｉｎｂｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｍｉｘｅｄｃｒｙｓｔａｌ，ｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｂｉｆａｌｖｏｎｏｉｄｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＬＣ－ＭＳ．ＴｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｂｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｗｉｔｈＤＰＰＨａｓｓａｙ，ｂｙ蛇毒血凝酶
ｕｓｉｎｇＬ－ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄａｓｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．ＴｈｅｂｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｍｉｘｅｄｃｒｙｓｔａｌｗａｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆＡｍｅｎｔｏｆｌａｖｏｎｅ
，Ｒｏｂｕｓｔａｆｌａｖｏｎｅ，Ｂｉｌｏｂｅｔｉｎ，４＇－Ｍｅｔｈｏｘｙｒｏｂｕｓｔａｆｌａｖｏｎｅ，ＰｏｄｏｃａｒｐｕｓｆｌａｖｏｎｅＡ．Ｗｈｅｎｔｈｅｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ５２．３μｇ／ｍＬ，ｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｒａｔｅｏｆｔａｔｏｌｂｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｗａｓ８．０％，ｗｈｉｌｅｔｈｅＬ－ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｏｎＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｗａｓ９５．５％．ｂｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｆｒｏｍＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａｄｏｅｄｅｒｌｅｉｎｉｉｈａｖｅａｃｅｒｔａｉｎｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｎＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ
，ｂｕｔｍｉｌｄｅｒｔｈａｎＬ－ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａｄｏｅｄｅｒｌｅｉｎｉｉｈｉｅｒｏｎ；ｂｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ；ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ 石上柏是卷柏科卷柏属植物深绿卷柏ＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａｄｏｅｄｅｒｌｅｉｎｉｉＨｉｅｒｏｎ．的全草，为临床常用中药，具有清热，除湿，解毒的功效；主治咽喉肿痛，目赤肿痛，肺热咳嗽，湿热黄疸，风
湿痹痛［１］
netspy。
临床中还妇科等疾患。石上柏化学成分含有生物碱类和黄酮类等，其中所含有的双黄酮类是卷柏科以及某
些裸子植物的特征化学成分［２］
。这类成分具有抗氧化，抗肿
瘤，抗病毒，降血糖等活性［３－６］
。ＷａｎｇＧ等从深绿卷柏的乙酸
乙酯部位检测到９种具有抗氧化效果的双黄酮［７］
。而纯化后的总双黄酮的抗氧化活性尚未见报道。笔者对石上柏中的总双黄酮进行提取纯化，并分析组成，测试抗氧化活性。ＤＰＰＨ是一种稳定的氮中心的自由基，广泛用于评价各种合成的或天然
的抗氧化剂对自由基的直接清除作用［８］
。本研究利用ＤＰＰＨ自由基清除法评价石上柏中双黄酮类的抗氧化活性。
１ 仪器与试药
ＥＳ２２５ＳＭ－ＤＲ电子天平（瑞士普利赛斯公司），４０００Ｑ
ＴＲＡＰ液质联用仪（
美国ＡＢＳｃｉｅｘ公司），ＳＰＥＣＯＲＤｐｌｕｓ２１０紫外可见分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司），ＸＷ－８０Ａ微型旋涡混合仪（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）。
石上柏中药饮片（湖北辰美中药有限公司，产地湖北），经笔者鉴定为石上柏即深绿卷柏ＳｅｌａｇｉｎｅｌｌａｄｏｅｄｅｒｌｅｉｎｉｉＨｉｅｒｏｎ．的干燥全草，样品留存于湖北省中医院中药研究所标本室；抗坏血酸（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ，美国Ｓｉｇｍａ公司）；ＤＰＰＨ自由基（２，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ－１－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，美国Ｓｉｇｍａ公司）；聚酰胺粉（武汉
药科新技术开发有限公司）；
ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０（北京慧德易科技有限责任公司）；无水乙醇，，甲醇等试剂均为分析纯。
２ 方法与结果２．１ 双黄酮的提取与成分分析
取４０ｇ石上柏中药饮片用９０％乙醇５００ｍＬ回流提取５次，过滤，浓缩，干燥，得干膏。干膏经聚酰胺柱谱（３０～６０目），４０％～８０％乙醇洗脱，浓缩得双黄酮粗品；再经过ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ
－２０凝胶谱，
－甲醇洗脱，洗脱液浓缩后得黄粉末状双黄酮结晶１２０ｍｇ。采用ＨＰＬＣ－ＭＳ对样品进行分析，结
合参考文献［７］
皮黔生，检测到该双黄酮混合物由穗花杉双黄酮（５３９．２
［Ｍ＋Ｈ］＋），罗波斯塔双黄酮（５３９．２［Ｍ＋Ｈ］＋
），７－去甲基银
杏双黄酮（５５３．２［Ｍ＋Ｈ］＋
），罗波斯塔－４＇－甲醚（５５３．２［Ｍ＋
Ｈ］＋），罗汉松双黄酮Ａ（５５３．２［Ｍ＋Ｈ］＋）组成。
２．２ 双黄酮的抗氧化活性测试
取石上柏双黄酮混合结晶５．２３ｍｇ溶解于２５ｍＬ无水乙醇，
稀释得６种不同浓度的样品溶液（０．００２６～０．２０９２ｍｇ／ｍＬ）。另配制浓度为０．０５ｍｇ／ｍＬ的ＤＰＰＨ·无水乙醇溶液，以及６种不同浓度的抗坏血酸对照组溶液（０．００２９～０．２３１２ｍｇ／ｍＬ）。分别取１．０ｍＬ样品溶液或对照溶液与２．０ｍＬＤＰＰＨ·溶液加入４ｍＬ塑料离心管中，涡旋混匀，避光反应２０分钟，用紫外波长５１６ｎｍ测量吸光度，每个样品测三次取平均值。ＤＰＰＨ·清除率
用下式计算［７］
。Ｉ（％）＝［（Ａｂ－Ａｓ）／Ａｂ］×１００％，Ａｂ是空白
·
２１·ＳＨＡＮＤＯＮＧＣＨＥＭＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＹ ２０１９年第４８卷
大明湖的传说 第１６期样品吸光度，Ａｓ是反应液吸光度。实验得到石上柏中双黄酮与
对照组抗坏血酸对Ｄ
ＰＰＨ·清除率的结果见图１。由图可知，石上柏中双黄酮对ＤＰＰＨ·的清除率随其浓度的增加而增大，实
验浓度范围内，石上柏中双黄酮对Ｄ
ＰＰＨ·的最大清除率为８．０％，而抗坏血酸为９５．５％
。
图１ 化合物对ＤＰＰＨ自由基的清除曲线
３ 讨论
在实验的浓度范围内，石上柏中双黄酮无法达到清除一半
的ＤＰＰＨ·的效力，不便于计算半数清除率浓度ＩＣ５０，表明其对ＤＰＰＨ·的清除能力弱。分析原因是与双黄酮的结构有关。文献报道黄酮化合物酚羟基取代基的位置和数目等能影响抗氧化活性，Ｂ环酚羟基构型是清除自由基的决定因素，黄酮类化合
物清除·ＯＨ的活性与Ｂ环酚羟基数目呈显著的正相关性［９］
。
例如，ＴａｔｔｉｎｉＭ等报道芹菜素７－Ｏ－糖苷熄灭Ｏ－
２的ＩＣ５０ ５００μＭ，显著弱于芦丁－７－Ｏ－糖苷的ＩＣ５０值５
８．２±３ ７μＭ［１０］。本实验测试的石上柏双黄酮混合物（包含穗花杉双黄酮，罗波斯塔双黄酮，
７－去甲基银杏双黄酮，罗波斯塔－４＇－甲醚，罗汉松双黄酮Ａ）的结构都属于双芹菜素型，Ｂ环只有一个酚羟基，故而清除自由基能力不强。本实验结果与以往黄酮
抗氧化构效关系的报道并行不悖，也为双黄酮的深入研究、开
发、利用提供了一定的参考。
参考文献
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红狼牙鰕虎鱼
ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｏｍ
ｔｒａｎｓｆｅｒｄｕｒｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ１
，１－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌｒａｄｉｃａｌａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ［Ｊ］．ＡｎａｌＣｈｉｍＡｃｔａ，２０１２，７１１：９７－１０６．［９］吕 娜．黄酮类化合物的抗氧化性与其化学结构的关系
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ｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍａｔｅｓｉｎｌｅａｖｅｓｏｆＬｉｇｕｓｔｒｕｍｖｕｌｇａｒｅｕｎｄｅｒｅｘｃｅｓｓｌｉｇｈｔａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．ＮｅｗＰｈｙｔｏｌ，２００４，１６３：５４７－５６１．（本文文献格式：朱田密，陈树和，张金亮，等．石上柏中双黄酮对ＤＰＰＨ自由基的清除作用研究［Ｊ］．山东化工，２０１９，４８（１６）：１２－１３．檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
）（上接第１１页）
人体因为与外界的持续接触，包括呼吸（氧化反应）、外界污染、放射线照射等因素不断的在人体体
内产生自由基。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。本实验表明牡蛎中脂肪酸对超氧阴离子有很好的清除作用，体现出很好的抗氧化性，这对于由自由基引起的疾病，如 炎症、辐射损伤肿瘤、衰老等有一定的意义［１５］
，它作为天然保健食品的开发有一定价值。
由于牡蛎已大规模养殖，产量大，价格低，因此是提取不饱和脂肪酸的好原料。本文为充分利用和开发牡蛎的使用价值，提供了科学依据。
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春：东北师范大学，
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１９９１．（本文文献格式：贾静文，赵丽娟，罗维巍，等．大连牡蛎中脂肪酸的提取分析及抗氧化性研究［Ｊ］．山东化工，２０１９，４８（１６）：９－１１，１３．）
·贞元集团
３１·朱田密，等：石上柏中双黄酮对ＤＰＰＨ自由基的清除作用研究
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