邱丽娟;孟欣;候升书;杨根金;仲维清
【摘 要】目的 研究槲皮素与其锌离子(Zn2+)配合物的抗氧化性能.方法 通过紫外/可见分光光度法测定槲皮素与Zn2+的结合比例及结合常数,结合核磁共振技术确定其结合位点,以1,1-二苯基苯肼(DPPH)为探针,比较研究槲皮素与其Zn2+配合物的抗氧化性能.结果 当槲皮素中低于2个酚羟基被中和时,槲皮素与Zn2+的饱和结合比为2:1;当超过3个酚羟基被中和时,槲皮素与Zn2+的结合比为1:1,此时槲皮素-Zn2+的表观结合常数为2.42×106 M-1.槲皮素的3'-O、4'-O参与了与Zn2+的配位.槲皮素-Zn2+配合物清除DPPH自由基的活性比槲皮素本身高出2.3倍.结论 Zn2+可与槲皮素形成稳定的配合物,且其比槲皮素本身具有更高效的抗氧化性能,这为传统中药槲皮素的应用提供了新思路.%Objective To study the anti-oxidation properties of Zn2+-quercetin complexes .Methods The binding stoi-chiometric ratios and the binding constant of Zn2+ to quercetin were measured with UV-Vis spectroscopy .The binding sites on quercetin were determined via1 H NMR spectroscopy .The antioxidant activities of Zn2+-quercetin complexes were compared to quercetin by scavenging DPPH radical metho d .The binding ratio of Zn2+ to quercetin depends on neutralization of phenol groups of quercetin .Results The binding ratio of Zn2+ to quercetin is 1:2 when less than two OH groups were deprotonated . The binding ratio is 1:1 when more than three OH groups were deprotonated .The apparent binding constant is 2 .42 × 106 M -1 for the 1:1 Zn2+-quercetin complex .The 3′-OH and 4′-OH of quercetin are involved in the Zn2+ binding .The scavenging DPPH radical activity of Zn2+-quercetin complex is 2 .3 times of quercetin .Conclusion These results provide a new insight to expand applications of this traditional Chinese medicine .
声索国【期刊名称】《药学实践杂志》
【年(卷),期】2018(036)001
【总页数】5页(P50-54)
【关键词】槲皮素;锌离子;结合常数;抗氧化
【作 者】邱丽娟;孟欣;候升书;杨根金;仲维清惠普收购康柏
【作者单位】第二军医大学 基础医学院,上海200433;第二军医大学 药学院,上海200433;第二军医大学 药学院,上海200433;第二军医大学 药学院,上海200433;第二军医大学 药学院,上海200433
【正文语种】中 文
【中图分类】O657
槲皮素(quercetin，Que)是一种天然药物的活性成分， 具有降血压、抗炎等多种生物活性[1-3]。 槲皮素含有5个酚羟基和1个酮基， A、C环(图1)构成稳定的共轭体系， 槲皮素分子中B环上的3′-OH、4′-OH对抗氧化活性的贡献更大[1,2,4,5]。 据文献报道，槲皮素可与Zn2+形成配合物， 而槲皮素分子上的5个酚羟基以及酮基都有可能是Zn2+的结合位点[6-9]。 鉴于槲皮素与Zn2+形成配合物的组成及结构都未明确， 我们对槲皮素与Zn2+螯合的性质进行了研究， 以期明确Zn2+与槲皮素配合物的组成及结合位点， 以及对其抗氧化性能的影响，为进一步阐明槲皮素-金属配合物的生物活性机制提供参考。唐太宗十八学士
图1 槲皮素的结构
1 实验仪器与材料
1.1 仪器
Lambda 25 型紫外/可见分光光度计(Perkin Elmer)，AVANCE Ⅱ 600 Hz NMR(德国BRUKER公司)。
1.2 材料
槲皮素(含量>97%，上海紫一试剂厂)，其他试剂为市售分析纯。
2 实验方法
2.1 紫外-可见光谱
一氧化氮合成酶
取12.5 μl的槲皮素乙醇溶液(4 mmol/L)于测量池中，加入NH3的乙醇溶液(4 mmol/L)12.5 μl([NH3]∶[Que] = 1∶1)调节pH值，以无水乙醇作参比，在Lambda 25 型紫外-可见分光光度计上测其250～600 nm的紫外-可见吸收光谱，再按[ZnCl2]∶[Que] = 0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.4∶1、1.6∶1、1.8∶1、2.0∶1分别加入ZnCl2的乙醇
溶液，测反应混合物的紫外可见吸收光谱。按照[NH3]∶[Que] = 2∶1、3∶1、4∶1改变NH3与Que的比例，分别按上述相同比例滴加ZnCl2乙醇溶液，同法测其紫外-可见吸收光谱。实验温度控制在25 ℃。
2.2 NMR实验
1H NMR实验在德国BRUKER AVANCE Ⅱ 600 Hz NMR仪上完成，溶剂为CD3OD；谱宽SW=15 ppm，温度为27 ℃，数据点SI=64 k。
2.3 槲皮素及其与锌配合物抗氧化性能实验
为比较槲皮素与槲皮素-锌配合物的抗氧化性能，以无水乙醇作参比，在517 nm处测定1,1-二苯基苯肼(DPPH)溶液(50 mg/L，乙醇溶剂)的紫外-可见吸收峰值A0，以及DPPH分别与不同量的槲皮素、槲皮素-锌配合物的混合液(室温下静置30 min)的吸收峰值A。
取500 μl上述DPPH溶液于石英比池中，加入16 μl的槲皮素乙醇溶液，以0.1 s间隔测517 nm 的吸收峰值A。按照下列公式计算槲皮素清除DPPH的反应速率常数k值：
ln(A-A∞)=-kt+ln(A0-A∞)
其中A∞为反应完成时(30 min)的吸光值。以槲皮素-锌配合物代替槲皮素，同法测其清除反应的速率常数。中国旅游报
3 结果与讨论
3.1 槲皮素与Zn2+结合性质
槲皮素的紫外-可见吸收光谱示于图2([Que]∶[NH3] = 1∶4)，其中257 nm附近的吸收峰归属于A环电子π-π*跃迁，379 nm附近的峰归属于B环电子π-π*跃迁[7]。逐渐加入ZnCl2后，257 nm和379 nm附近的峰的强度均逐渐减弱，而在272 nm附近和437 nm附近峰的强度逐渐增强。当ZnCl2与槲皮素的浓度比为1.4∶1时，各吸收峰的强度基本不再变化。
图2 槲皮素及其与ZnCl2在乙醇中反应的紫外-可见光谱图
注： [ZnCl2]∶[Que]0=0∶1、0.2∶1、 0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.4∶1、1.6∶1、1.8∶1、2.0∶1。实验温度25 ℃，[Que]∶[NH3]=1∶4，槲皮素的终浓度为0.10 mmol/L
将槲皮素-锌配合物的吸收光谱对槲皮素本身的吸收光谱作差谱处理，取437 nm左右吸收峰的吸光度差值ΔA与[Que]0之比对[ZnCl2]∶[Que]0作图(图3)，从图3可以看出，当向槲皮素中加入ZnCl2后，在反应前期阶段，吸光度随ZnCl2的浓度线性增加，到[ZnCl2]∶[Que]=1.4∶1后，吸光度几乎不再增加，前后两段曲线的线性拟合直线的交点对应[ZnCl2]∶[Que]≈1.0∶1，表明Zn2+与槲皮素的饱和结合比约为1∶1。
当[Que]∶[NH3] 逐渐降为1∶3、1∶2、1∶1时，与[Que]∶[NH3] = 1∶4时相比，虽然槲皮素与ZnCl2反应液的紫外-可见光谱图的总体变化情况相似，但达到滴定饱和时所需的ZnCl2的量不完全相同，当[Que]∶[NH3]=1∶3时，槲皮素与Zn2+的饱和结合比仍为1∶1，但当[Que]∶[NH3]=1∶1时，槲皮素与Zn2+的结合比变为约2∶1(图3)。
图3 (ΔA/[Que]0)～([ZnCl2]/[Que]0)曲线图■[Que]∶[NH3]=1∶1，●[Que]∶[NH3]=1∶2，▲[Que]∶[NH3]=1∶3，▼[Que]∶[NH3]=1∶4注：槲皮素的终浓度为0.10 mmol/L，实验温度25 ℃
对槲皮素-Zn2+形成的1∶1型配合物，按下列公式(Q代表槲皮素，忽略电荷)计算其表观结合常数K：
Zn2++Q=ZnQ
[Zn2+]0=[Zn2+] +[ZnQ]
[Q]0 =[Q] + [ZnQ]
以对作图(Hill-Plot [10]，见图4)，斜率为1/K。
不同条件下测定的表观结合常数K值列于表1中。
图4 ( [Q]0/[ZnQ] )～(1/[Zn2+])及线性拟合图表1 槲皮素与ZnCl2的反应结合常数
[NH3]∶[Que]K(M-1)3∶1(2．50±0．23)×1064∶1(2．33±0．22)×106
本研究选用的Zn2+试剂是ZnCl2，需采用氨水预先部分中和掉槲皮素酚羟基中的H+。实验发现，槲皮素与Zn2+的结合比例取决于槲皮素上去质子的酚羟基的数目(即溶液的酸碱度)。当NH3与槲皮素的浓度比小于2∶1时(只有2个以下酚羟基被中和掉)，槲皮素与Zn2+形成2∶1型配合物；当NH3与槲皮素的浓度比大于3∶1时(超过3个酚羟基被中和掉)，槲皮素与Zn2+形成1∶1型配合物，此时，槲皮素-锌配合物的平均表观结合常数为2.42×10
6 M-1。
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