第37卷第6期农业工程学报 V ol.37 No.6
282 2021年3月Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Mar. 2021 高产生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性 张悦，贺银凤※，顾悦，王艳，郑砚学
（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018）
摘要：为了揭示乳酸菌生物膜抵抗不良环境的作用机制，该研究以2株乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和2株植物乳杆菌RJ1-1-4、RM1-1-11（菌株均高产生物膜）为研究对象，探究浮游态、被膜态菌株对酸、碱、胆盐、模拟人工胃肠液的耐受能力以及抗氧化能力。结果表明：在极酸条件下，菌株生长受到抑制，但是pH值3.0时，被膜态RM1-1-11生长量显著高于浮游态（P<0.05）。随着pH值递增，菌体密度增加，在pH值7.0-9.0时，碱性环境对除TG1-1-10外其他3株菌的生长有一定抑制作用；当胆盐浓度为0～0.03%时，菌株生长有小幅度上升，且被膜态菌株RJ2-1-4、TG1-1-10生长量显著低于浮游态（P<0.05）；但随着胆盐浓度继续增加，菌株生长受到抑制，除浮游态菌株TG1-1-10外，其余3株菌被膜态菌株生长量均显著高于浮游态；菌株在模拟人工胃肠液中处理3 h后发现，相比于浮游态菌株，被膜态各菌株在胃、肠液中的存活率均有所提高。
4株菌对于不同种类自由基均有一定清除能力，清除率从高到低分别为HO·、DPPH·、脂质过氧化、超氧阴离子，其中RJ1-1-4浮游态菌悬液对DPPH·清除率为214.12 μg/mL，RJ2-1-4被膜态无细胞提取物、TG1-1-10浮游态无细胞提取物对HO·清除率分别为713.81 μg/mL和637.01 μg/mL，RJ2-1-4浮游态无细胞提取物对超氧阴离子清除率为93.80 μg/mL，RM1-1-11被膜态菌悬液对脂质过氧化物的清除率为122.82 μg/mL。结果表明：生物被膜状态下的乳酸菌对于酸、碱、胆盐、模拟人工胃肠液均有一定的保护作用，但是菌株间存在特异性，即使是同一种属也不相同；被膜态菌株的抗氧化能力高于浮游态，但是对于不同种类自由基会有不同的结果。该结果为进一步研究乳酸菌在被膜态下抵抗环境胁迫的作用机制提供依据。
关键词：菌；抗氧化；生物膜；乳酸菌；抗逆性
doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034
中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2021)-06-0282-07
张悦，贺银凤，顾悦，等. 高产生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性[J]. 农业工程学报，2021，37(6)：282-288.
doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034
Zhang Yue, He Yinfeng, Gu Yue, et al. Stress resistance and antioxidant properties of lactic acid bacteria with high biofilm production[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(6): 282-288. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034
0 引 言
乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）在自然界中种类繁多且分布广泛[1]，因其良好的益生特性[2-3]，被广泛应用于食品、饲料和药品等领域。然而，发酵产品在加工及运输过程中，会受到一些如酸、碱、高温等不利因素的影响，使乳酸菌活细胞数显著减少，如果LAB对胃肠道环境不耐受，那么其发挥益生特性的能力也会受到影响。因此寻求提高LAB存活率的方法，对于有益乳酸菌发酵产品的开发利用具有重要意义。目前常用的提高LAB存活率的方法有：改良菌种保护剂法、微胶囊法、添加低聚糖等物质促进菌株生长、基因重组改良LAB特性法以及生物膜法[4-8]。生物膜是细菌粘附于惰性物体或活体生物表面生长、繁殖，由其自身分泌的胞外多聚基质所包被起来形成的一种具有高度组织化的微菌落聚集
收稿日期：2020-10-13 修订日期：2021-03-09
基金项目：国家自然科学基金项目(31960467)；内蒙古自治区自然科学基金项目(2019BS03002)；内
蒙古自治区研究生科研创新资助项目(B20191147Z) 作者简介：张悦，研究方向为食品生物技术。
Email：***********************
※通信作者：贺银凤，博士，教授，研究方向为食品生物技术。
Email：******************体[9]，是菌体为抵御不良环境而发展形成的一种自我保护模式。由于生物膜是菌体自身的生物合成，因此受到学术界的广泛关注。研究证明，生物膜状态下的乳酸菌较浮游状态耐热、耐氧能力大幅度提升；使用含有生物膜的纳米纤维膜作为发酵剂发酵酸奶，不但显示出优异的发酵能力，而且菌株在货架期内的存活率更高。由此可以发现，生物膜的形成不仅可以提高菌株存活率，还促进菌株对不利环境的适应，提高细菌的耐受性，确保菌株稳定发挥益生作用[10-12]。
生物氧化（Biological Oxidation）是生物体内有机物质在酶的催化下发生氧化反应生成CO2和H2O，并释放大量能量的过程。由于一些内源性或者外源性因素的影响，机体和细胞会处于氧化应激状态[13]，从而引发糖尿病、阿尔兹海默症、癌症等一系列疾病并导致衰老[14-18]。目前对于乳酸菌抗氧化应激已得到体内外试验的验证，但是对其作用机制的研究尚不明确，对于被膜态菌株清除不同种类自由基能力的研究还未见报道。
本试验选择课题组前期分离筛选得到的4株高产生物膜乳酸菌，对其在浮游态、被膜态下对酸、碱、
依那普利拉注射液
胆盐、模拟人工胃肠液的存活能力，以及抗氧化能力进行探究，拟为提高乳酸菌在食品工业中的生存能力和利用率提供新的视角；同时也为乳酸菌抗氧化机理的研究提供新思路。
第6期张悦等：高产生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性283
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
本试验受试菌株分离自西藏地区牦牛乳制品，分别为2株乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10（分别分离自酸曲拉和牦牛酸奶）和2株植物乳杆菌RJ1-1-4、RM1-1-11（分别分离自酸曲拉和牦牛奶），均保藏于内蒙古农业大学食品生物技术团队实验室。
1.1.2 培养基
试验所用到的MRS培养基参考顾悦[19]的方法配制。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH），Coolaber公司；酵母提取粉、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、牛胆盐，购自广东环凯微生物科技有限公司；醋酸钠、柠檬酸氢二胺、磷酸氢二钾、葡萄糖、维生素C、硫酸亚
铁、水杨酸、无水乙醇、三，购自国药集团化工试剂有限公司；焦性没食子酸，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；试验中使用的水均为去离子水。
1.1.3 仪器与设备
HF-SAFE 1500型生物安全柜、SMART-N纯水机，力康生物医疗科技控股有限公司；SX-500型全自动高压灭菌锅，日本TOMY公司；PB 10型酸度计，德国Sartorius 公司；5810R型高速低温离心机，德国Eppendorf公司；紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 浮游态菌株供试菌液的制备
将活化至第三代的菌液倒入10 mL离心管，10 000 r/min离心5 min后弃上清液，再加入5 mL 0.85%的生理盐水，吹打混匀后按照上述离心条件离心处理5 min，弃上清。如此重复3次以洗涤菌体，第3次洗涤完成后弃上清，再加入适量生理盐水，调节菌液的吸光度OD595nm值在 1.0左右。此时细菌的细胞浓度为1×107 CFU/mL，由此制得浮游态菌株的供试菌液[11]。1.2.2 被膜态菌株供试菌液的制备
duzhe将菌株活化至第二代后按照2%体积分数的接菌量传菌于新鲜培养基，吹打混匀后吸取5 mL于6孔细胞培养板中，在培养前用封口膜缠绕6孔板缝隙处，最后放入37 ℃培养箱培养24 h，得到被膜态菌株。
按照1.2.1节中的方法将细菌的细胞浓度调节为1×107 CFU/mL，由此获得被膜态菌株的供试菌液[20]。
1.2.3 菌株最适生长pH值的测定
以2%体积分数的接种量，将上文制备好的浮游态和被膜态供试菌液分别接种至pH值为9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液体培养基，以未接菌的相应pH值的培养基作为空白对照组，每个梯度设置两个平行组。于37 ℃条件下培养24 h，测定吸光度OD595nm 值，筛选出不同状态下耐酸能力较强的菌株并确定其耐受范围。
1.2.4 菌株对不同浓度胆盐耐受能力的测定
以2%体积分数的接种量，将上文制备好的浮游态和
被膜态供试菌液分别接种至含有质量分数分别为0、0.03%、0.10%、0.20%和0.30%的牛胆盐MRS液体培养基，以未接菌的MRS液体培养基为空白对照，每个梯度设置两个平行组。于37 ℃条件下培养24 h，测定吸光度OD595nm值，从而筛选出不同状态耐胆盐能力较强的菌种及其相应耐受范围。
1.2.5 菌株对模拟人工胃液的耐受能力的测定
沃岭生分别取浮游态和被膜态菌株的供试菌液，按照菌液∶胃液=1∶9的体积比例注入到人工胃液中，并混合均匀。在37 ℃条件下静置培养3 h，之后适当进行梯度稀释，选择3个适宜稀释度，各取1 mL加入灭菌培养皿，在培养皿中加入适量培养基与菌液一起摇匀，于37 ℃条件下培养36～48 h后再进行平板菌落计数。以人工模拟胃液中初始培养的菌株存活数作为空白对照组，求得平均值，计算存活率，从而筛选出对胃液有良好耐受性的菌株[20-21]。
胃液中存活率=(N1/N0)×100% （1）式中N1为经过模拟胃液培养 3 h后的平板菌落总数，(CFU/mL)；N0为模拟胃液初始培养的平板菌落总数，(CFU/mL)。
1.2.6 菌株对人工模拟肠液的耐受能力的测定
分别取浮游态和被膜态菌株的供试菌液，按照菌液∶肠液=1∶9的体积比例注入到人工肠液，并混合均匀，在37 ℃条件下静置培养3 h。之后按照1.2.5节中的方法培养并进行平板菌落计数。以人工模拟肠液中初始培养的菌株存活数作为空白对照组，求得平均值，计算存活率，从而筛选出对人工模拟肠液有较好耐受性的菌株[22-23]。
肠液中存活率=(N’1/N’0)×100% （2）式中N’1为经过人工模拟肠液培养3 h后的平板菌落总数，(CFU/mL)；N’0为人工模拟肠液初始培养的平板菌落总数，(CFU/mL)。
1.2.7 菌株抗氧化能力的测定
1）细胞悬浮液的制备
将1.2.1一节中培养的三代菌液倾倒于10 mL离心管中，离心（4 ℃，4 000 r/min，10 min），弃去上清，吸取5 mL超纯水吹打混匀，重复两次，重悬，得到细胞悬浮液。
2）无细胞提取物(Cell Free Fermentation Supernatant, CFS)的制备
将上文中制得的细胞悬浮液利用超声波破碎仪（280 W，破碎5 s，间隔5 s，共处理10 min）冰浴处理，经显微镜检查无完整细胞后离心（4 ℃，12 000 r/min，10 min）取上清液。
3）清除自由基DPPH·试验
用维生素C溶液、1 mL蒸馏水替代样品，分别为阳性对照组和阴性对照组，用1 mL无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液为空白组，1.5 mL蒸馏水与同体积无水乙醇混合溶液调0。清除率按公式（3）计算：其中A i为样品组的吸光值，A j为空白组的吸光值，A0为对照组的吸光值[24]。
DPPH
·1100%
i j
A A
A
-
=-⨯
清除率（3）以0、50、100、150和200 μg/mL的维生素C为横坐
农业工程学报（ ） 2021年
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标，对DPPH ·清除率为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为：Y =0.398X +7.033，R 2=0.992，可用于后续试验。
4）清除HO ·自由基试验
用维生素C 溶液替代样品为阳性对照组，空白组为蒸馏水。清除率按以公式（4）计算：其中A x 为样品组的吸光值，A 0为空白组的吸光值[25]。
0HO 1100%x A
利益相关者理论
A ⋅=-⨯清除率 （4） 以0、100、200、300、400、500、600、700、800 μg/mL 的维生素C 为横坐标，对HO ·清除率为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为：Y =0.123X +0.805，R 2=0.993，可用于后续试验。
5）清除超氧阴离子试验
用维生素C 溶液替代样品为阳性对照组，空白组为蒸馏水。清除率按以公式（5）计算：其中A 样为样品组的吸光值，A 空为空白组的吸光值[26-27]。
1100%A
A =-⨯样空
超氧阴离子清除率 （5）
以0、50、100、150、200、250、300 μg/mL 的维生素C 为横坐标，对超氧阴离子清除率为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为：Y =0.3X +10.748，R 2=0.993，可用于后续试验。
6）清除脂质过氧化物试验
用维生素C 溶液替代样品为阳性对照组，空白组为蒸馏水。清除率按以公式（6）计算：其中A 样为样品组的吸光值，A 空为空白组的吸光值[27]。
100%A A A -=
⨯空样
空
脂质过氧化物清除率 （6）
以0、50、100、150、200 μg/mL 的维生素C 为横坐标，对脂质过氧化物清除率为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为：Y =0.383X +8.718，R 2=0.990，可用于后续试验。
1.3 数据分析
利用SPSS 23.0中的one-way ANOVA 和Origin 2018进行数据的分析及作图，测定结果以平均值±标准偏差表示。
2 结果与分析
2.1 不同状态下乳酸菌对酸、碱耐受结果
在人体众多防御机制中，胃酸提供的强酸环境对微生物的影响最大。胃液的pH 值因个体差异和饮食结构的不同有较大波动，正常人胃液的pH 值为1.5-2.0。食物在胃内停留的时间从几分钟到几小时不等，因此绝大多数微生物因不耐酸而被杀灭，只有极少数具有较强耐酸能力的乳酸菌能够顺利通过胃酸屏障，到达肠道内发挥其益生作用。因此益生性乳酸菌必须具备耐酸特性，才能在胃肠消化道中保持一定的数量[28]。4株菌浮游态、被膜态菌株最适生长pH 值范围及耐酸、碱能力结果如图 1所示。
a. 不同状态的乳酸片球菌RJ2-1-4对酸、碱耐受情况 a. Acid-and alkali-resistant of Pediococcus lactis RJ2-1-4 in different states
b. 不同状态的乳酸片球菌TG1-1-10对酸、碱耐受情况 b. Acid-and alkali-resistant of Pediococcus lactis TG1-1-10 in different states
c. 不同状态的植物乳杆菌RJ1-1-4对酸、碱耐受情况 c. Acid- and alkali-resistant of Lactobacillus plantarum RJ1-1-4 in different states
d. 不同状态的植物乳杆菌RM1-1-11
对酸、碱耐受情况 d. Acid- and alkali-resistant of Lactobacillus plantarum M1-1-11 in
different states
注：*表示不同状态菌株在同一pH 值下差异显著（P<0.05）。OD 595nm 表示在595nm 时的吸光度值，下同。
Note: *Showed that there were significant differences among different strains at the same pH value(P<0.05). OD 595nm represents the absorbance value at 595nm, the same below.
图1 不同pH 值对不同状态乳酸菌生长的影响
Fig.1 Effects of different pH value on the growth of strains in different LAB
由图1可知，在pH 值1.0-3.0时，极酸性环境完全抑制了浮游态菌株的生长，在pH 值 3.0时，被膜态R
M1-1-11的菌体密度显著高于浮游态（P<0.05）。随着pH 值递增，菌体密度逐渐上升，浮游态的乳酸片球菌RJ2-1-4在pH 值6.0时达到最大生长量，乳酸片球菌TG1-1-10、植物乳杆菌RJ1-1-4则在pH 值7.0时达到最大生长量，而植物乳杆菌RM1-1-11则是在pH 值9.0时达到最大生长量。在pH 值7.0-9.0时，碱性环境对除RM1-1-11外其他3株菌的生长有一定抑制作用，但是4株被膜态乳酸菌生长量均高于浮游态。通过观察图1可以发现，在pH 值为5.0-6.0的范围内，除RM1-1-11，浮游态菌株的生长量总体上高于被膜态菌株，出现这样的
结果可能是由于酸胁迫下，相关的酸敏感应激蛋白变性甚至失去活性，生物膜结构发生改变，从而造成菌体间的拮抗，影响菌株的生长[29]。从上述结果可以得出，大部分被膜态菌株对酸碱环境的耐受能力比浮游态的高，而且存在菌株特异性。
2.2 不同状态下乳酸菌对胆盐耐受结果
胆盐是肝细胞分泌的胆汁酸和牛磺酸或甘氨酸结合得到的钠盐或钾盐，人体小肠中胆盐质量分数一般维持在0.03%～0.30%，胆盐能够改变菌体细胞膜的通透性，从而抑制、杀灭乳酸菌。因此，乳酸菌要在人体内发挥益生功效，必须对胆盐有一定的耐受力[30]。4株乳酸菌浮游态和被膜态对胆盐耐受能力如图2所示。
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由图2可知，胆盐浓度为0～0.03%时，菌株生长有小幅度上升，且被膜态菌株RJ2-1-4、TG1-1-10生长量显著低于浮游态（P<0.05）；但随着胆盐浓度继续增加，菌株生长受到抑制，此时除浮游态菌株TG1-1-10在0.10%胆盐
浓度生长量高于被膜态，其余3株菌被膜态菌株生长量均显著高于浮游态。虽然菌株生长受到抑制，但是菌株被膜态对菌体起到保护作用，使得菌株对于高浓度胆盐有一定耐受能力。
a. 不同状态的乳酸片球菌RJ2-1-4对胆盐耐受情况 a. Tolerance to bile salt for Pediococcus lactis RJ2-1-4 in different states
b. 不同状态的乳酸片球菌TG1-1-10对胆盐耐受情况 b. Tolerance to bile salt for Pediococcus lactis TG1-1-10 in different states
c. 不同状态的植物乳杆菌RJ1-1-4对胆盐耐受情况 c. Tolerance to bile salt for Lactobacillus plantarum RJ1-1-4 in different states
d. 不同状态的植物乳杆菌RM1-1-11
对胆盐耐受情况 d. Tolerance to bile salt for Lactobacillus plantarum RM1-1-11 in
different states
注：*表示不同状态菌株在同一pH 值下差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
Note: * represents significant differences in strains of different states under the same pH value (P<0.05) and ** indicates significant differences (P<0.01).
图2 不同浓度胆盐对不同状态乳酸菌生长的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of bile salts on the growth of different LAB
2.3 不同状态下乳酸菌对人工模拟胃液的耐受能力
人体胃液的主要成分为胃蛋白酶和盐酸，呈酸性，正常水平下维持在pH 值3.0左右，空腹状态下甚至可达到pH 值1.5，因此乳酸菌对于胃液的胁迫作用要有一定抵抗作用才能生长和发挥其益生功能。浮游态及被膜态菌株耐胃液能力测定结果如表1所示。
表1 浮游态和被膜态菌株在模拟人工胃液中存活情况 Table 1 The survival of planktonic and biofilm strains in
simulated artificial gastric juice
存活率Survival rate/%
菌株编号 Bacteria number
浮游态 Planktonic
被膜态 Biofilm
RJ2-1-4 7.75±0.94Bb
36.59±2.85Ac TG1-1-10 6.29±5.09Bb 22.13±4.17Ad RJ1-1-4 56.49±0.10Aa 58.66±2.24Ab RM1-1-11 51.67±2.37Ba
76.28±4.35Aa
注：表中不同大写字母表示同一株乳酸菌不同状态时差异显著；小写字母表示不同乳酸菌在同一状态下差异显著（P<0.05），下同。
Note: Different capital letters in the table indicate that the same strain of lactic acid bacteria has significant differences in different states; lower case letters indicate that different lactic acid bacteria have significant differences in the same state (P<0.05). The same below.
从表1中可以看出：在胃液中培养3 h 后，相比于菌株RJ2-1-4和TG1-1-10的存活率，菌株RJ1-1-4和RM1-1-11的存活率维持在较高水平，且前两株菌的存活率与后两株菌存在显著差异（P<0.05）。
相比于浮游态菌株，被膜态各菌株在胃液中的存活率均有所提高，在胃液中培养3 h 后，存活率由小到大依次是22.13%，36.59%，58.66%，76.28%，即菌株耐胃液能力由弱到强依次是TG1-1-10，RJ2-1-4，RJ1-1-4，RM1-1-11。由此可见，生物被膜状态下的菌株对模拟胃液的耐受性更高。
2.4 不同状态乳酸菌对模拟人工肠液的耐受能力
肠液呈微碱性，主要成分为胰蛋白酶和胆盐，对于乳酸菌生长有胁迫作用。乳酸菌在人体肠道内的活菌数达到108 CFU/mL 以上时，才满足其发挥益生特性的要求[31]。浮
游态及被膜态菌株耐肠液能力测定结果如表2所示。
表2 浮游态和被膜态菌株在模拟人工肠液中存活情况 Table 2 The survival of planktonic and biofilm strains in
simulated artificial intestinal fluid
存活率Survival rate/%
菌株编号 Bacteria number
浮游态 Planktonic 被膜态Biofilm
RJ2-1-4 34.63±3.61Ab
43.83±1.51Ab TG1-1-10 60.06±2.03Aa 69.78±2.46Aa RJ1-1-4 34.60±1.58Ab 41.46±5.10Ab RM1-1-11 37.78±0.81Bb 64.97±0.52Aa
从表2中可以看出：菌株在肠液中培养3 h 后，浮游态存活率由小到大依次为34.60%，34.63%，37.78%，60.06%，即菌株RJ1-1-4，RJ2-1-4和RM1-1-11对肠液的耐受能力相近，而菌株TG1-1-10的耐受能力较高，与前三者存在显著差异。
相比于浮游态菌株，被膜态各菌株在肠液中的存活率均有所上升，但上升幅度不同。在肠液中培养3 h 后，存活率由小到大依次是41.46%，43.83%，64.97%，69.78%，即菌株RJ2-1-4和RJ1-1-4不存在显著差异，耐受能力相对较低，菌株RM1-1-11和TG1-1-10之间也不存在显著差异（P>0.05），但耐受能力相对较高。由此可见，被膜态菌株可提高对肠液环境的耐受性，提高菌株在肠道内的存活率，使其能进一步发挥其保留益生作用。
由上述对浮游态、被膜态菌株环境抗逆性的研究，不难发现生物被膜状态下的菌株对不良环境的耐受性更强。为了验证被膜态菌株的抗氧化特性是否强于浮游态菌株，本试验设计不同种类自由基来探究不同状态下菌株的抗氧化能力。
2.5 不同状态菌乳酸菌株抗氧化能力
乳酸菌的抗氧化应激已经得到体内外的试验证实，但是对其机理研究尚不明确。且对于被膜态菌株抗氧化的研究较少，因此通过对生物膜状态下菌株抗氧化能力进行研究，可以为氧化应激机理的研究提供新思路。
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人道主义援助
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浮游态和被膜态菌株对不同自由基的清除率如图3所示。4株菌均有清除自由基能力，但是不同状态对不同种类自由基的清除能力不同，且同一种属之间清除率也不相同。对于DPPH·自由基，菌株RJ2-1-4、TG1-1-10、RM1-1-11浮游态与被膜态对自由基清除能力无显著差异（P>0.05），但是经过超声波破碎后，除RM1-1-11，其他两株乳酸片球菌清除率均降低；而RJ1-1-4浮游态菌株对DPPH·清除率较被膜态高，其中浮游态菌悬液的清除率为214.12 μg/mL ；大部分菌株经超声波破碎后清除率呈现下降趋势，说明菌株对DPPH·自由基的清除作用并非单凭胞内某些活性物质，与其活细胞的一些抗氧化机制密切相关。对于HO·自由基，两株乳酸片球菌均表现出无细胞提取物对HO·的清除能力均显著高于菌悬液的，菌株RJ2-1-4被膜态无细胞提取物对HO·的清除能力为713.81 μg/mL ，而菌株TG1-1-10浮游态无细胞提取物对HO·的清除能力
为637.01 μg/mL 。两株植物乳杆菌则表现出被膜态对HO·的清除能力均显著高于浮游态的（P<0.05）。对于超氧阴离子，与HO·自由基结果相似，乳酸片球菌RJ2-1-4不同状态下菌悬液对超氧阴离子均无清除能力，而菌悬液无细胞提取物的清除率与被膜态无细胞提取物相近，达到93.80 μg/mL 。说明细胞内可能存在某些具备清除超氧阴离子的物质且不同菌株间存在差异。对于脂质过氧
化物，菌株对其都表现出不同抑制作用，但是4株菌均表现出被膜态菌悬液的清除能力最好，其中RM1-1-11被膜态菌悬液的清除率最高，为122.82 μg/mL 。这可能是由于清除脂质过氧化物的酶等物质大多存在于细胞表面，且菌株在成膜过程中会分泌类似物质，从而表现出被膜态菌悬液清除能力好[32]。由上述结果可知，总体上被膜态菌株的抗氧化能力高于浮游态，但是对于不同种类自由基会有不同的结果，具体作用机制还有待进一步研究。
a. 不同状态的乳酸片球菌RJ2-1-4对不同自由基清除情况 a. Clearance of different radicals by Pediococcus lactis RJ2-1-4 in different states
b. 不同状态的乳酸片球菌TG1-1-10对不同自由基清除情况 b. Clearance of different radicals by Pediococcus lactis TG1-1-10 in different states
c. 不同状态的乳酸片球菌RJ1-1-4对不同自由基清除情况 c. Clearance of different radicals by Lactobacillus plantarum RJ1-1-4 in different states
d. 不同状态的乳酸片球菌RM1-1-11
对不同自由基清除情况 d. Clearance of different radicals by Lactobacillus plantarum RM1-1-11 in
different states
注：乳酸菌对不同种类自由基的清除率以维生素C 的浓度来表示。不同字母表示不同状态对同种自由基清除率差异显著（P<0.05）。
Note: The Clearance of lactic acid bacteria to different kinds of free radicals is expressed by the concentration of vitamin C. Different letters indicate that different states have significant differences in the same radical clearance (P<0.05).
图3 不同状态乳酸菌对不同种类自由基的清除率
Fig.3 Clearance of different kinds of radicals by strains in different LAB
3 结 论
1）乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和植物乳杆菌RJ1-1-4、RM1-1-11， 4株乳酸菌在不同pH 值环境中时，被膜态乳酸菌菌体密度总体上高于浮游态菌株。当pH 值为5.0-6.0时，浮游态乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和植物乳杆菌RJ1-1-4生长量高于被膜态；乳酸片球菌RJ2-1-4、RM1-1-11在pH 值7.0-9.0时，被膜态菌株生长量呈现逐渐上升的趋势，且菌体密度高于浮游态。
2）耐胆盐试验中，浮游态和被膜态4株乳酸菌的生长量都会随着胆盐浓度的升高而下降。在胆盐浓度为0.30%的环境下，浮游态菌株中只有菌株TG1-1-10表现出一定的耐受性，而被膜态菌株中，除了菌株RM1-1-11外，其他菌株都具有一定耐受性。
3）模拟人工胃液的耐受性试验中，4株乳酸菌均表现出一定耐受性，但耐受能力各异。浮游态菌株中，菌株RJ1-1-4存活率最高，为56.49%；TG1-1-10存活率最低，为6.29%，说明菌株TG1-1-10的耐受能力最差。被
膜态乳酸菌的耐受能力显著提高（P>0.05），其中菌株RM1-1-11表现出最强耐受能力，存活率可以达到76.28%。模拟人工肠液的耐受性试验中，浮游态菌株TG1-1-10存活率最高，为60.06%；菌株RJ
1-1-4的存活率最低，为34.60%。被膜态乳酸菌对肠液的耐受能力显著提高（P>0.05），耐受能力较好的菌株TG1-1-10存活率可由原来的60.06%提升至69.78%。
秩和比4）4株乳酸菌对于不同种类自由基均有一定清除能力，清除率从高到低分别为HO·、DPPH·、脂质过氧化、超氧阴离子。其中RJ2-1-4被膜态无细胞提取物、TG1-1-10浮游态无细胞提取物对HO·清除率分别为
713.81 μg/mL 和637.01 μg/mL ，RJ1-1-4浮游态菌悬液对DPPH·清除率为214.12 μg/mL ， RM1-1-11被膜态菌悬液对脂质过氧化物的清除率为122.82 μg/mL ， RJ2-1-4浮游态无细胞提取物对超氧阴离子清除率为93.80 μg/mL 。
4株高产生物膜乳酸菌在生物被膜状态下对于酸、碱、胆盐、人工胃肠液均有一定的耐受性，可以提高LAB 在不良环境中的存活率。但是抵御不良环境的能力存在菌株差
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