熊何健;吴国宏;王莉芳;乔小瑞
少阳病【摘 要】通过响应面法试验设计,优化山竹外果皮中多酚类物质的提取工艺,并对其清除自由基活性进行了研究.多酚浸提的最佳工艺参数为:乙醇溶液体积分数60%、液料比18: 1、浸提时间66 min,在此条件下,多酚浸出率为11.38%.提取液经XDA-7大孔树脂柱层析纯化,得山竹多酚,样品多酚含量为87.19 % ,其清除DPPH、羟基自由、超氧阴离子自由基IC50值分别为:4.67 mg/L、41.4 mg/L和27.0 mg/L. 【期刊名称】《河南工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2010(031)005
【总页数】6页(P25-29,70)
载体桩
【关键词】山竹;多酚;制备;自由基
【作 者】熊何健;吴国宏;王莉芳;乔小瑞
【作者单位】集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021
【正文语种】中 文
【中图分类】TS201.1
山竹 (Garcinia m angostanaL)又名山竹子、莽吉柿、凤果,为藤黄科藤黄属的一种种间杂交的异源多倍体果树,原产于马来岛,是一种典型的热带水果[1],主要分布于泰国、越南、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾等东南亚国家,我国台湾、福建、广东和云南也有引种[2].山竹果实可食部分占29%～45%,含有蛋白质、脂肪、多种维生素及丰富的矿物质元素,其中柠檬酸含量 0.63%、维生素 C为 12 mg/kg、可溶性固形物 16.8%,有机酸0.63%[1].山竹外果皮呈黑紫红,切片晒干后可作药用,一直作为泰国传统医药,用于腹痛、腹泻、痢疾、感染性创伤、化脓、慢性溃疡、白带、淋病等疾病的[3].
山竹前期研究多集中在山竹的栽培[4-5]、营养成分、无机元素、风味成分的分析[3,6]及山
竹果壳中红素的利用等方面[7,8].近年来的研究表明,占单果鲜重 52%～68%的山竹外果皮中,含有氧杂蒽酮、单宁酸和原花青素等一系列多酚类化合物,具有抗氧化、抑制肿瘤等诸多生理活性[9-11],有较高的开发利用价值.作者以山竹外果皮为原料,多酚为目标组分,通过单因素试验和响应面分析法等建立山竹外果皮中多酚类物质的分离制备工艺,并对其清除自由基活性进行检测,为山竹多酚的工业化生产与应用提供依据.
山竹:购于厦门集美,收集外果皮,干燥,0℃以下储藏备用.
没食子酸、DPPH、福林-酚试剂:sigma公司;羟自由基、超氧阴离子自由基检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;XDA—7大孔树脂:西安蓝晓科技有限公司;其他试剂均为分析纯.
1.2.1 工艺流程再生魔
山竹外果皮→粉碎→溶剂浸提→浸提液真空浓缩→浓缩液→树脂吸附→有机溶液洗脱→洗脱液真空浓缩→冷冻干燥→山竹多酚.
1.2.2 提取条件的选择
干燥山竹外果皮粉碎,过 40目筛.各取 2.00 g山竹皮粉末,乙醇溶液超声波浸提,超声频率 40 kHz,超声功率 100 W收集浸提液,测定浸提液中多酚含量,计算多酚浸出率,比较不同浸提条件对多酚浸出效果的影响.
1.2.3 大孔吸附树脂纯化
山竹外果皮粉末经溶剂浸提后,浸提液真空浓缩回收溶剂,浓缩液上 XDA—7大孔树脂柱(200 mm ×28 mm)吸附,吸附速率 2 BV/h,吸附完成后用 2 BV蒸馏水洗脱,然后用 60%乙醇溶液常温洗脱,洗脱速率 4 BV/h,收集洗脱液,真空浓缩,冷冻干燥.
1.2.4 多酚含量的测定[12]
福林 -酚试剂分光光度法,样品中多酚含量以没食子酸计.以没食子酸质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,所得回归方程为:Y=0.009 4X+0.003 7(R2=0.999 7).
1.2.5 样品清除自由基活性测定
清除 DPPH活性:分光光度法[13].
清除O2-·、·OH自由基活性:按照检测试剂盒检测方法测定.
分别用 0、20%、40%、60%、80%乙醇溶液作为浸提液超声浸提山竹外果皮,分析浸提液体积分数对多酚浸出率的影响,结果见图 1.
由图 1可知,随着乙醇体积分数的增加多酚提取率不断提高,当乙醇体积分数达到 60%左右时提取率达到最大值,浸提液体积分数进一步提高,多酚提取率反而降低,这与山竹外果皮中多酚类物质的构成与极性有关.
分别采用不同浸提时间 (30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)对原料进行超声波浸提处理,分析浸提时间对山竹壳多酚提取率的影响,结果见图 2.
由图 2可知,60 min时多酚类物质基本达到浸出平衡,继续延长时间,多酚浸出率增加缓慢,同时,浸提时间过长,山竹壳中的杂质成分溶解也随之增加,将会影响多酚的纯化.
分别采用液料比 9︰1、12︰1、15︰1、18︰1、21︰1、24︰1对原料进行超声波浸提处理,分析浸提液料比对山竹壳多酚提取率的影响,结果见图 3.
由图 3可知,液料比达到 18︰1时,原料中的多酚物质已基本溶出,继续增加溶剂的用量,浸出率趋于稳定,生产中过大的料液比也会造成后续浓缩时能耗增加和溶剂的浪费.
在单因素试验的基础上,采用响应面分析法(Response Surface Analysis,简称 RSA),并根据Box-Benhnken中心组合原理,设计 3因素 3水平的响应面分析试验,对浸提条件进行优化.灵媒百科
2.4.1 分析因素的选取以及响应面试验结果蓓舒宁
以液料比 X1(15︰1、18︰1、21︰1)、浸提时间X2(45 min、60 min、75 min)和浸提液体积分数 X3(50%、60%、70%)3个因素为自变量,以多酚浸出率 Y为响应值进行试验,试验结果见表1.
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2.4.2 试验模型的建立和最优化分析
利用 Design Expert 7.0软件对表1试验数据进行多元回归拟合,获得响应值多酚浸出率 Y对自变量液料比 X1、浸提时间 X2和浸提液体积分数 X3的二次多项回归模型方程为:
Y= -19.67+1.9933X1+0.25533X2+0.15950X3-5.6111E-003X1X2+3.9167E-003 X1X3+5.5E-004X2X3-0.0507X21-1.4056E-003X22-2.31250E-003X23.
回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验判定,P值越小,则相应变量的显著程度越高,回归分析结果列于表2.
由表2可知,3个试验因子中对响应值影响的主次顺序为 X2＞X1＞X3,即浸提时间 ＞液料比 ＞浸提液浓度,对响应值的影响达到极显著水平,X3、X1X2、X23对响应值的影响也达到显著水平,表明试验因子对响应值不是简单的线性关系,二次项和交互项对响应值都有很大关系.
模型 P=0.003 5,表明该二次多项回归模型高度显著.失拟检验 P=0.115 9＞0.05,不显著,无失拟因素存在,模型充分拟合试验数据,R2=0.966 4,说明预测值和实测值之间具有高度的相关性,因此可用此模型对试验进行分析和预测.
响应指标对应于因素 X1、X2、X3水平构成的一个三维空间图,可以直观地反映各因素对响应值的影响,从因素交互作用的等高线及响应面图(图 4、图 5、图 6)可以分析出它们之间的相互作用.由图 4～图 6可知,在所选范围内存在极值.运用 SAS软件确定模型因素的最佳水平,理论最优条件为乙醇体积分数 57.76%,液料比18.26︰1,浸提时间 65.69 min,模型预测的最大浸出率11.52%.考虑实际操作的局限性,将理论值修正为乙醇体积分数 60%,液料比 18
︰1,浸提时间66 min,在此条件下进行浸提试验,多酚浸出率为 11.38% ±0.05%(n=3),与理论值的误差为1.48%,表明模型能较好地预测实际浸出率.
利用响应面优化得到的最佳浸提条件浸提山竹外果皮原料,浸提液浓缩,经 XDA-7大孔吸附树脂纯化,洗脱液浓缩、冻干,得山竹多酚,多酚含量为87.19%.
1,1-二苯基 -2-三硝基苯肼 (DPPH)是一种稳定的以氮为中心的脂质自由基,DPPH清除活性通常作为天然抗氧化剂初期筛选的检测指标[14-15].超氧阴离子自由基 (·)、羟自由基(·OH)是生物体内两种重要的氧自由基,·是多种自由基中间体的母体,·OH的氧化活性极强,能与活细胞中任何生物大分子发生反应,引起脂质过氧化、DNA损失和多糖的降解等,对机体危害极大,对·和·OH的清除能力是抗氧化物质活性检测的重要指标[16-18].
配制一定浓度经柱层析纯化的山竹果皮多酚样品的水溶液,检测其清除 DPPH、羟自由基和超氧阴离子自由基活性,结果见图 7、图 8和图 9.
山竹多酚表现出良好的自由基清除活性,且随质量浓度的增加清除作用增强,存在明显的量效关系.根据自由基清除曲线的趋势线方程,计算山竹多酚清除自由基 IC50值,结果见表3.
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