1.总黄酮的测定
1.1 实验仪器
电子天平吕思勉AR2140;
紫外可见分光光度计UV2754;
型数控超声波清洗器KQ3200DB;
超级恒温槽;
Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ;
FD21C250 冷冻干燥机2
1.2 试剂及药品
芦丁 标准品
硝酸铝 国产分析纯（配成5 %）
亚硝酸钠 国产分析纯（配成10 %）
氢氧化钠 国产分析纯配成（配成1mol/L）
95%乙醇，无水乙醇 国产分析纯（配成60%乙醇 50%乙醇）
DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）
Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）
没食子酸对照品：基准纯。
大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔
1.3实验步骤：
1.3.1准备工作及波长的确定
样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。
1.3.2参照品芦丁标准溶液的制备
精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL德里克 安德森 容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。
1.3.3标准品的测量及绘制标准曲线
精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于10mL 容量瓶中，并定容至刻度线。得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min 后,分别在510nm 处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）。（以试剂空白做参比）
以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A
的线性回归方程以及相关系数R2。
序号 | 浓度（ug/ml） | 吸光度 |
1 | 0 | 0 |
2 | 15 | 0.180 |
3 | 30 | 0.349 |
4 | 45 | 0.546 |
5 | 60 | 0.727 |
6 | 75 | 0.884 |
7 | 90 | 1.063 |
| | |
表1-1： 芦丁标准曲线测定数据
图1-2：芦丁标准曲线
1.3.5样品的测试
根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。取黄酮提取液， 取提液2ml至10ml的比管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液。其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol 氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,片断教学放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量。
样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)
式中：X—测出的浓度，mg/ mL;（直接代入，不用换算。）
n—稀释倍数，量纲为1;
VI—样液总体积，mL;
V—测定时取样体积，mL;
W—样品质量，g。
2.总分含量的测定
2.1 实验仪器
ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;
DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;
容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比管管(10mL);
烧杯、移液管、吸耳球。
2.2试剂及药品
没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50℃真空干燥箱真
空中干燥4 h。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2.3 Folin—Ciocalteu比法测定总酚酸含量
3.3.1 Folin—Ciocalteu试剂的配制
称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，加入10ml 85％的磷酸溶液和20 ml浓盐酸，文火回流10 h，然后加入3 g硫酸锂及15 ml双
氧水，加热沸腾15 min至亮黄，不得带微蓝和绿。冷却，移入250 ml容量瓶中，定容，贮于棕瓶中，4℃冰箱保存。
2.3.2对照品溶液制备
准确称取15．00 mg干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液。
将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分别取1mL置于10mL的容量瓶中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h(Guo&Wei,2011)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜的干扰，同时制作不加显剂的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。刮刀涂布
2.3.3标准曲线的制备
以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2樟脑油。
序号 | 澳门科技大学2020年本科招生浓度（ug/ml） | 吸光度（WL765.0） |
0 | 0 | 0 |
1 | 3 | 0.132 |
2 | 6 | 0.284 |
3 | 9 | 0.411 |
4 | 12 | 0.582 |
5 | 15 | 0.712 |
6 | 18 | 0.843 |
7 | 21 | 1.013 |
| | |
表3-1：没食子酸标准曲线测定数据
图3-1：没食子酸标准曲线
2.3.4样品的测定
取提液2ml至10ml的比管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比管中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜的干扰，同时制作不加显剂的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。
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