常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li

常见体外抗氧化实验方法

(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3


DPPH·自由基清除法	2
ABTS·+自由基清除法	5
FRAP法 (铁还原法)	8
过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)newcom	11
羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法)	14
PTIO·自由基清除法(水溶液中)	16
CUPRAC法(铜还原法)	18
铁络合能力(Ferrozin法)	20
脂质过氧化清除法(亚油酸为底物)	23
抗氧化产物的预测	26

DPPH·自由基清除法/DPPH法

原理：

DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。

当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。

实验操作[1]:

1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）

取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。该DPPH溶液避光保存，4h内用完。

（注意：如果是用分光光度计，则A＝0.6±0.02比较合适）

1.2 样品液的配置

样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。

1.3 预试

取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪情况，当溶液颜基本褪去时，记下样品的加样量。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

在预试过程中，发现加样到10μL时，DPPH溶液颜基本褪去，则10μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为2μL、4μL、 6μL 、8μL、10μL。

A0值测量：取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0宜在0.20±0.01）。如果是用分光光度计，则A0宜在0.6±0.02比较合适。当然，也可以高一点，或低一点。

A值测量

取（20-x）μL 95乙醇（或无水乙醇）加入到96孔板中，加样品液 xμL （x是根据1.3 节预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液80μL，混合， 37℃水浴30min， 37℃水浴1h，测A值。

加样：如，设定某样品的用量梯度为2μL、4μL、 6μL 、8μL、10μL，则加样表如下：

样品液	甲醇	DPPH溶液	总体积
2μL	18μL	80μL	100μL
4μL	16μL	80μL	100μL
6μL	14μL	80μL	100μL
8μL	12μL	80μL	100μL
10μL	10μL	80μL	100μL

2.1最终测量

通过测量，会发现某物质的清除率随浓度增加而升高，这就是所谓的“量效关系”“浓度依赖曲线”。这是一个初步的结果，最终结果还要经过一次规范的测量。每测一个用量需要测三个平行数据。

2.2DPPH清除率（抑制率）的计算

清除率＝（1- A / A0）*100

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3.使用注意事项：

3.1酶标仪测量法：每次使用前，都先测量空板吸光度并保存数据，实际吸光度=测量吸光度-空板吸光度。

3.2当加入较少量样品（如2μL）时，移液器尽量垂直打入孔内，如挂液在头可轻轻触碰孔内液体使其吸附，但注意下次取样需换头；如样品沾到孔壁，可把移液器调制10μL左右，吸取孔内溶液以冲壁，同样下次取样需换头。以上操作头均不能触碰孔板底以免损坏头。

3.3 96孔板：每次使用后96孔板需用洗衣粉水浸泡超声，后用清水洗净，再用蒸馏水浸泡，晾干。

【实例】

三个化合物(老鹳草素geragiin, 柯里拉京corilagin和TGG(1,3,6-trigalloyl glucose))的DPPH清除数据（BHA和Trolox为阳性对照组）

DPPH法实验数据
	浓度μg/mL	吸光度			A0值	清除率1	清除率2	清除率3	清除率平均值	SD值
Geraniin	0	0.209	0.197	0.206	0.204	0	0	0	0	0
	1.9	0.134	0.135	0.133		34.313	33.823	34.803	34.313	0.491
	3.8	0.058	0.05	0.075		71.568	75.490	63.235	70.098	6.259
	5.7	0.029	0.019	0.014		85.784	90.686	93.137	89.869	3.744
	7.6	0.009	0.007	0.005		95.588	96.568	97.549	96.568	0.981
	9.5	0.005	0.006	0.007		97.549	97.058	96.568	97.058	0.490

Corilagin	0	0.193	0.209	0.199	0.200	0	0	0	0	0
	1.9	0.177	0.162	0.157		11.5	19	21.5	17.3333	5.204
	3.8	0.132	0.121	0.104		34	39.5	48	40.5	7.053
	5.7	0.055	0.045	0.043		72.5	77.5	78.5	76.1666	3.215安徽p2p网贷
	7.6	0.024	0.012	0.006		88	94	97	93	4.583
	9.5	0.005	0.004	0.003		97.5	98	98.5	98	0.5

1,3,6-Trigalloyl glucose	0	0.195	0.215	0.2	0.203	0	0	0	0	0
	1.9	0.146	0.149	0.154		28.078	26.6009	24.1379	26.2725	1.991
	3.8	0.081	0.086	0.1		60.098	57.6354	50.7389	56.1576	4.852
	5.7	0.041	0.024	0.033		79.802	88.1773	83.7438	83.9080	4.190
	7.6	0.013	0.024	0.024		93.596	88.1773	88.1773	89.9835	3.129
	9.5	0.009	0.011	0.012		95.566	94.5812	94.0886	94.4544	0.753


BHA	0	0.208	0.220	0.212	0.213	0	0	0	0	0
	1.9	0.160	0.154	0.164		24.882	27.6995	23.0046	25.1956	2.363
	3.8	0.161	0.148	0.159		24.4131	30.5164	25.3521	26.7605	3.287
	5.7	0.131	0.121	0.145		38.4976	43.1924	31.9248	37.8716丁惟宁	5.6598
	7.6	0.116	0.103	0.119		45.5399	51.6431	44.1314	47.1048	陈宝琛3.9929
	9.5	0.102	0.087	0.087		52.1126	59.1549	59.1549	56.8075	4.0658

Trolox	0	0.209	0.214	0.214	0.212	0	0	0	0	0
	1.9	0.168	0.17	0.148		20.7547	19.8113	30.1886	23.5849	5.739
	3.8	0.123	0.137	0.125		41.9811	35.3773	41.0377	39.4654	3.572
	5.7	0.069	0.071	0.068		67.4528	66.5094	67.9245	67.2955	0.721
	7.6	0.025	0.025	0.032		88.2075	88.2075	84.9056	87.1069	1.907
	9.5	0.001	0.005	0.005		99.5283	97.6415	97.6415	98.2704	1.089

据上表，作图如下：

图 DPPH·清除法的浓度曲线图

Experimental

The DPPH· radical scavenging method was described in the previous study [1]海德格尔此在. Briefly, 80μL of DPPH· solution (0.1 M) were mixed with methanolic sample solutions at the indicated concentration (x = 0–10 μL, 0.5 mg/mL). The total volume of mixture was adjust

ed to 100 L, and maintained at room temperature for 1 min, and the absorbance was measured at 519 nm on a microplate reader. The percentage of DPPH· scavenging activity was calculated using the equation (1):

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