吴慧;卢蓉蓉;沈浥;凌玉芳;周蕊大丹直指
【摘 要】采用不同蛋白酶酶解乳清浓缩蛋白,以DPPH自由基清除率评价抗氧化活性,确定胰蛋白酶为最佳酶源.依次采用大孔吸附树脂、凝胶层析、制备型和分析型反相高效液相谱分离纯化酶解物.最后得到A3a和A3b两个纯化多肽,经Q-TOF MS分析得到氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL和LYEDLKPTPEGPMEL.A3a和A3b的DPPH自由基清除IC50分别为2.51和4.95μg/mL.结果表明,乳清蛋白抗氧化肽具有较小分子量和特定氨基酸序列,能够有效清除自由基,可作为食源性抗氧化剂. 【期刊名称】《食品与发酵工业》2013广东高考理综
【年(卷),期】2010(036)010
【总页数】波特率5页(P6-10)
【关键词】乳清蛋白;抗氧化肽;分离纯化;DPPH自由基;氨基酸序列
【作 者】吴慧;卢蓉蓉;沈浥;凌玉芳;周蕊
【作者单位】江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122
【正文语种】中 文
现代自由基学说指出，活性氧自由基会导致脂质、蛋白质和DNA氧化性退化，激活致癌原，抑制细胞内抗氧化系统等氧化损伤，会引发糖尿病，心血管疾病，神经组织退化紊乱和癌症等多种慢性病的发生［1］。抗氧化剂由于能清除机体内自由基而具有抗衰老，预防癌症等作用，因此可以作为功能因子用于食品、药品和保健品的开发。在众多的抗氧化剂种类中，人工合成的抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对二苯酚(TBHQ)等具有毒副作用，所以安全、高效、无毒的天然抗氧化剂的开发应用成为国内外研究热点。
已有一些研究表明了动植物源蛋白的抗氧化性，例如牛奶蛋白［2］、玉米醇溶蛋白［3］和小麦醇溶蛋白［4］等。乳清蛋白是干酪的副产物，过去常作为废料未加以利用，关于乳
清蛋白的高营养、高功能和高生物价值的报道［5］使得它在各种食品、药物和化妆品中广泛应用。近年来的研究发现［6］，乳蛋白的一级结构中分布着具有生物活性的氨基酸序列，通过特定的蛋白酶水解，可将其以活性肽段释放出来，显示其特殊的功能效应。目前从不同的乳蛋白降解产物得到了多种具有生理功能的活性肽，大多集中于酶法制备，鲜见分离纯化至明确序列的肽段。 因此，本文分离纯化乳清蛋白水解物，获得高抗氧化活性的肽段，明确其氨基酸序列，为乳清蛋白抗氧化肽的作用机制研究和应用研究提供理论依据。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验原料
热稳型ALACEN392乳清浓缩蛋白粉WPC80，新西兰恒天然(NZMP)公司。DA201-C大孔吸附树脂，江阴市有机化工厂。
1.1.2 实验试剂
2709碱性蛋白酶(2×105u/g)，Trypsin胰蛋白酶(4×103u/g)，Papain木瓜蛋白酶(8×105u/g)，无锡雪梅酶制剂有限公司;Protamex®复合蛋白酶(1×105u/g)，Flavorzyme® 风味蛋白酶(2 ×104u/g)，Novo公司;Protease N®蛋白酶(2.5×105u/g)，日本天野酶制剂有限公司;二苯基苦基苯肼(DPPH)，Sephadex G-15葡聚糖凝胶，美国 Sigma公司;α-脱氧-D-核糖，美国Fluka公司;抗坏血酸，国药集团化学试剂有限公司;乙腈，甲醇，谱纯，江苏汉邦科技有限公司;其它均为AR级试剂。
1.1.3 主要设备
4K15冷冻离心机，Sigma公司;722型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;LGJ－10冷冻干燥器，北京四环自动化设备有限公司;Water 600高效液相谱仪，美国Waters公司。
1.2 实验方法
1.2.1 乳清蛋白水解物的制备
邵阳学院学报将乳清蛋白粉配制成一定底物浓度的溶液，搅拌均匀，90℃预处理5 min，迅速降温至酶解
反应温度并在酶反应器中保温10 min，用0.5 mol/L NaOH调pH至酶的最适值后加酶，采用pH-stat法控制反应体系的pH值在设定pH±0.05之间，反应结束后，沸水浴灭酶10 min，迅速冷却，添加1.0 mol/L HCl调pH至7.0，8 000 r/min冷冻离心30 min，上清液冷冻干燥后备用。水解度(DH)测定采用pH-Stat法［7］。
1.2.2 DA201-C大孔吸附树脂初步纯化
采用文献［8］中的方法。各指标计算如下:
式中:Md，大孔产物蛋白质量，mg;Mo，酶解物蛋白质量，mg;Co，吸附液起始蛋白浓度，mg/mL;Cx，吸附液平衡蛋白浓度，mg/mL;V－吸附液体积，mL;W－树脂(干)质量，g;Vd，解吸液体积，mL;Cd，解吸液蛋白浓度，mg/mL。
1.2.3 凝胶谱分离纯化
将经过预处理的Sephadex G-15装成Φ1.6 cm×100 cm柱，将样品溶解在2 mL流动相中上柱(50 mg/mL)，并用流动相超纯水以流速24 mL/h洗脱，同时用紫外检测仪在220 nm进行检测。
1.2.4 反相高效液相(RP-HPLC)分离纯化
制备型 RP-HPLC洗脱条件:谱柱:Hedern ODS－2 C18P/N 84176(Φ10 mm ×250 mm，江苏汉邦有限公司);检测波长220 nm;柱温35℃;进样浓度30 mg/mL;进样量25 μL;流速 2 mL/min;流动相:A－超纯水(体积分数0.05%TFA)，B－乙腈(体积分数0.05%TFA);0 min:90%A+10%B;20 min:40%A+60%B;25 min:100%B。
分析型 RP-HPLC洗脱条件:谱柱:C18S/N MT101(Φ4.6 mm ×150 mm)(Waters公司);检测波长220 nm;柱温35℃;进样浓度10 mg/mL;进样量10 μL;流速1 mL/min;流动相:A－超纯水(体积分数0.05%TFA)，B－乙腈(体积分数0.05%TFA);0 min:90%A+10%B;20 min:60%A+40%B。氨基甲酸酯
1.2.5 氨基酸序列分析
液相谱条件:检测器:WATERS ACQUITY PDA;分析柱:BEH C18(Φ2.1 mm ×100 mm);检测波长220 nm;柱温30℃;流速0.3 mL/min;流动相:A－超纯水(体积分数0.2%甲酸)，B－乙腈;0 min:100%A;15 min:50%A+50%B;20 min:100%B。
质谱仪条件:离子方式ESI+;毛细管电压2.5 kV;锥孔电压30 V;离子源温度100℃;脱溶剂气体温度250℃;脱溶剂气体流量600 L/h;锥孔气体流量50 L/h;碰撞能量70 V;质荷比扫描范围:50～3 000 m/z;检测电压1 600 V。
1.2.6 DPPH自由基清除活性测定
参考Sun等人的方法［9］，略作改动。取2 mL试样与2 mL DPPH无水乙醇溶液混合(1×10－4mol/L)，在室温下反应30 min后在517 nm处测定吸光值Ai。DPPH自由基的清除率按式(5)计算:
式中:A0，对照组吸光度;Ai，样品组吸光度;Aj，空白组吸光度。
文中未做特别说明时，样品浓度为10 mg/mL。
1.2.7 数据统计与分析
文中数据为3次平行测定值的平均值。采用SPSS统计软件(SPSS12.0，美国SPSS公司)在显著性水平 P=0.05 下，进行数据统计与分析［10］。a，b，c，d不同字母代表差异显著，P＜0.05。
2 结果与讨论
2.1 乳清蛋白水解物的制备及抗氧化活性
分别采用碱性蛋白酶，胰蛋白酶，中性蛋白酶，复合蛋白酶，木瓜蛋白酶和风味蛋白酶水解乳清蛋白制备抗氧化肽，以水解度表示蛋白质的降解程度，各种酶对乳清蛋白的水解进程曲线见图1。
图1 各种酶对乳清蛋白的水解进程曲线
由图1可见，反应前60 min水解度增加较快，后90 min趋于平缓。这可能是由于随着产物浓度的增加抑制了反应的进行，反应中间复合物在经历初始阶段积累后达到稳态，趋于恒定［11］，此外酶在一定的反应pH值和温度下部分失活，考虑成本及效率，在实验中选择反应时间为90 min。
采用水解度和DPPH自由基清除率双指标(表1)，进一步筛选出水解乳清蛋白的最佳用酶。表1显示，碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解乳清蛋白后的水解度较高，分别为25.09%和20.17%。其他蛋白酶的水解度都低于20%。采用DPPH自由基清除率评价水解物的抗氧化
活性，结果表明，胰蛋白酶解物的抗氧化活性显著高于其他酶(P＜0.05)，DPPH自由基清除率为67.01%。此外，胰蛋白酶酶解条件为微碱性，不必使用过多的碱液调节，节约成本，简化工艺;而且，采用动物蛋白酶进行水解可以减轻或避免人体内消化酶对酶解物产品的影响，因此将其选作实验用酶。脂60%乙醇溶液洗脱产物WPHs-60的DPPH自由基清除活性最高(P＜0.05)达到84.40%(样品浓度10 mg/mL)，静态吸附和解吸的效果如表2所示，与程云辉［8］报道相比结果较好。
表2 DA201-C大孔吸附树脂对乳清蛋白抗氧化肽的吸附和解析性能吸附率/% 吸附量/(mg·g－1) 解吸率/% 回收率/%78.80 31.16 96.24 75.86
表1 乳清蛋白不同酶解产物的DH和DPPH自由基清除率/%2709碱性蛋白酶 25.09±0.51e 63.85±0.87酶的种类 水解度/% DPPH自由基清除率c Trypsin胰蛋白酶 20.17±0.40d 67.01±0.80d Protease N中性蛋白酶 15.60±0.30c 38.84±0.71a Protamex复合蛋白酶 10.07±0.37b 40.53±0.86a Papain木瓜蛋白酶 4.50±0.31a 47.84±0.72b Flavourzyme风味蛋白酶 4.61±0.32a 45.89±0.87b
2.2 乳清蛋白抗氧化肽的大孔吸附树脂脱盐
采用pH-stat法制备乳清蛋白抗氧化肽，水解液中含有一定的盐分，会影响产品的抗氧化性和之后的分离纯化。所以，首先采用大孔吸附树脂对水解物(WPHs)进行初步纯化。采用DA201-C大孔吸附树
2.3 乳清蛋白抗氧化肽的分离纯化
测定WPHs-60经Sephadex G-15分离后的洗脱曲线和各组分峰的抗氧化活性如图2(a)所示，其中A号峰的DPPH自由基清除活性最强(P＜0.05)，样品浓度为2 mg/mL时达到69.81%，自由基清除IC50为0.491 mg/mL。重复收集组分A进行后阶段的纯化。
用制备型RP-HPLC对A组分进行进一步纯化。由图2(b)看出，组分A仍然是一个复杂的成分，所有组分峰都集中在前20 min被洗脱。选择分离度较好的4个突出峰进行收集测定其抗氧化活性，其中峰A3的活性最高(P＜0.05)，样品浓度0.1 mg/mL时DPPH自由基清除率为74.14%，自由基清除IC50为0.038 1 mg/mL。
木蠹蛾
图2 乳清蛋白抗氧化肽的分离纯化注:(a)Sephadex G-15凝胶谱分离WPHs-60。得到5个组分(A－B)。分别测定它们的DPPH自由基清除率(样品浓度为2 mg/mL)。(b)制备型RP-H
PLC分离WPHs-A组分。得到4个组分(1－4)。分别测定它们的DPPH自由基清除率(样品浓度为0.1 mg/mL)。(c)分析型RP-HPLC分离WPHs-A3。得到2个组分(a－b)。分别测定它们的DPPH自由基清除率(样品浓度为0.01 mg/mL)。
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