【摘 要】目的：建立体外抗菌、抗氧化的实验模型研究重楼不同部位抗菌及清除自由基活性。方法：乙醇回流提取重楼中的有效成分，系统溶剂萃取得到了乙酸乙酯、正丁醇、水三种不同极性部位，采用液体稀释法和DPPH（二苯代苦味酰肼）法研究不同部位的抗菌、抗氧化活性。结果：重楼水部位抑制细菌作用较强，对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的MIC（最小抑菌浓度）分别为7.5mg/ml，12.5mg/ml；正丁醇部位抑制真菌作用较强，对白念珠菌的MIC为5mg/ml；乙酸乙酯部位具有较强清除自由基能力，DPPH的半数清除浓度约为1.0mg/ml，最大清除率为84.0%。结论：不同提取部位的抗菌及清除自由基活性有较大差异，重楼除正丁醇部位外的其它部位也具有良好的药理活性。 【关键词】重楼；自由基；抑菌活性；DPPH
重楼，又称七叶一枝花，是延龄草科 （Trilliaceae）， 重楼属 （Paris） 植物的泛称， 主产于我国西南各省区。重楼性味苦、微寒、有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，常用于肿痛、蛇毒咬伤等症，有重要的药用价值[1]。重楼药理活性强，临床应用范围广，研究表明重楼具有较强的抗肿瘤活性[2]，对金黄葡萄球菌、大肠杆菌等有
不同程度的抑制作用[3]，近年来还有研究表明重楼有一定的抗氧化作用[4]；目前认为重楼活性成分为正丁醇部位的甾体皂苷，甾体皂苷是天然产物中一类重要的化学成分，在植物中分布较为广泛，甾体皂苷具有多种生理活性， 如抗癌、抗菌、抗氧化、消炎作用等，并且不同部位的药理活性有较大差异。目前对于重楼不同部位清除自由基与抗菌活性的研究未见报道，因此本文研究了重楼乙醇提取物各部位清除自由基与抗菌活性，初步明确清除自由基与抗菌的不同活性部位。
1 材料与方法
1.1 试剂
二苯代苦味酰肼DPPH（Sigma公司）， 重楼饮片购自重庆桐君阁医药批发公司，牛肉浸膏（BR，北京奥博星生物技术责任有限公司），蛋白胨（BR，上海试剂二厂），琼脂粉（BR，Xiamen sanland chemincals company），其它试剂均为化学纯。
1.2 菌种
金黄葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白念珠菌
（Candida albicans），以上菌种均由本实验室传代保种。
1.3 实验仪器
756MC型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），分析天平（FA2104N），R-205旋转蒸发器（Switzerland BUCHI），SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市舒华仪器厂），恒温培养箱（BS-1E型），超净工作台（苏净公司），粉碎机，薄层谱GF254硅胶板（青岛海洋化工厂）。
1.4 方法
1.4.1 重楼各部位制备
重楼饮片粉碎后，用80%乙醇回流提取三次，减压浓缩，得乙醇总提取物。取适量用水分散，石油醚脱脂后依次用乙酸乙酯、正丁醇分别萃取5次，合并相同部分浓缩干燥，得乙酸乙酯部位、正丁醇部位、萃取后水层部位。将各部位用无水乙醇配制成浓度为200mg/ml的母液。
1.4.2 液体稀释法体外抑菌实验
将金黄葡萄球菌和大肠杆菌接种于M-H牛肉浸膏平板上，将白念珠菌接种于马丁培养基平板上，活化后配成相当于0.5麦氏管浊度的菌液。连续稀释配制成浓度为1.5625～100mg/ml系列的含药培养液，另设药液、培养基、和菌液三种对照管，在每一试管内接种相当于0.5麦氏管浊度的菌液25μl，混匀，置37℃温箱培养24h后观察有无浑浊，以不出现浑浊的最低浓度为该部位的 MIC，并于48h万科捐款门继续观察。共做3次平行试验。
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1.4.3 清除DPPH·自由基活性实验
二苯代苦味酰肼 （1，1-dipheny1-2-picrylhydrazy） 是一种稳定的有机自由基， 通过检测试样对DPPH 自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。该方法主要利用DPPH的紫红吸光度变化来检测试样清除自由基能力。用无水乙醇将DPPH配制浓度为6.5×10-4mol/l的储备液，将此母液稀释成不同浓度，以分光光度法分别测定A517吸光度，作标准曲线。稀释得到65μmol/L的DPPH·反应溶液，测定加药液后A517下降表示其对有机自由基消除能力。清除率越大，其抗自由基能力越强。每个处理均做三个重复。清除率（ %） = （A0 - A样）/A0 ×100 % 。A0 为未加样的 DPPH （2.5 ml DPPH + 0.5 ml无水乙醇） 的吸光度， A样为样品与 DPPH 反应后的平均吸光度。
2 结果
乙酸乙酯，正丁醇，水三个不同部位分别经TLC展开，发现各部位斑点基本没有重叠，分离效果较好，达到了不同部位分离的目的。不同部位分别用三氯醋酸、芳香醛-硫酸或高氯酸、硝酸铝-亚硝酸钠等显反应鉴别发现，乙酸乙酯部位含有黄酮和少量中等极性皂苷类化合物，正丁醇主要为皂苷类化合物，水部位主要为强极性皂苷类和酚性化合物，上述实验结果与文献报道一致[5]。
董其昌由体外抑菌实验结果可知，重楼各部位对金黄葡萄球菌、大肠杆菌和白念珠菌均有一定的抑制作用，重楼各部位抗真菌作用强于抗细菌作用。其中水部位对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用最强，其MIC分别为7.5mg/ml和12.5mg/ml；乙酸乙酯部位对大肠杆菌也有较强的抑制作用较强，其MIC为15mg/ml；正丁醇部位对白念珠菌的抑制作用较强，其MIC为5mg/ml。
DPPH标准曲线实验表明，在0.91×10-5～2.0×10-4mol/l范围内DPPH·溶液浓度与A 呈线性正相关关系。用最小二乘法作线性回归，得DPPH·溶液浓度（C×10-4mol L ）与 A 关系曲线的回归方程： y =0.177x+0.0395，R2 = 0.997。由此可见清除自由基活性实验中DPPH·
溶液的浓度65μmol/L是符合线性要求的。
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重楼对DPPH·的清除能力试验结果表明，重楼各部位均有一定的抗氧化作用，但有明显差异。在0.5～3mg/ml的浓度范围内，随着提取物浓度的增加，对DPPH·的清除率也增大，表明在一定范围内清除自由基的能力与其浓度呈明显的量效关系。当药液加人量达到一定值时，清除率趋于平缓，且各最大清除率较为一致，为80%左右。同时结果表明，相同浓度的不同部位清除DPPH·的能力不同，其大小顺序依次为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位≈醇提总部位。乙酸乙酯部位对DPPH·的半数清除浓度约为1.0mg/ml，水部位对DPPH·的半数清除浓度约为1.9mg/ml，正丁醇部位对DPPH·的半数清除浓度约为1.6mg/ml。
3 讨论
对重楼各部位所进行的抑菌药理实验显示，重楼药理活性较强。其醇提总部位对细菌、真菌均有一定的抑制作用，其中水部位抑制细菌作用最强，可能是重楼抑制细菌作用的物质基础。正丁醇部位在抑制真菌方面表现了较强的活性，抑制白念珠菌作用分别是乙酸乙酯部位、水部位的3倍和1.5倍，是研制开发抗真菌药的一个新来源。
瓶颈问题
另外，重楼提取物在清除自由基作用方面也有很好的应用前景。实验表明，重楼各部位具有良好的自由基清除能力，最大清除率都在80%左右。其中乙酸乙酯部位的效果最好，对虎门销烟教学设计DPPH的清除率最大为84%，对DPPH的半数清除浓度只有水部位的一半左右。因为水部位在质量上占醇提总部位的大部分，所以水部位与醇提总部位的DPPH的清除效果较为一致，但是相同浓度下醇提总部位的活性要略强于水部位，可能是乙酸乙酯部位作用所致，这进一步说明乙酸乙酯部位是清除自由基的主要有效部位。以上结果表明重楼除正丁醇部位外的其它部位也具有良好的药理活性，作为新的抗菌药源和天然抗氧化剂具有研究和开发价值，正丁醇部位具有开发新抗真菌药的潜力，同时对重楼各部位的其他药理作用和化学成分研究还有待做进一步的工作。
参考文献：
[1]王艳霞，李惠芬.重楼抗肿瘤作用研究[J].中草药，2005（4）.
[2]张霄霖，刘月婵.重楼的研究与应用[J].中国中医药科技，2000 （5）.
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