摘要：线粒体是细胞活动的“能源工厂”，在各种致病因素作用下线粒体极易出现各种结构和功能损伤，这在疾病的发展中起着十分重要的影响，文章就线粒体结构和功能损伤及其检测方法作一综述。 Abstract:Mitochondria are cell activities of the "energy factories", in a variety of pathogenic factors appear vulnerable to a variety of mitochondrial structure and function of injury, which in the development of the disease plays an important role. This article on the structure and function of mitochondrial damage and its detection methods are reviewed.
Key words: mitochondrial injury mtDNAApoptosis
线粒体在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义，而在各种致病因素作用下线粒体极易出现各种结构和功能损伤。在细胞凋亡过程中，内源性核酸内切酶、Caspase蛋白酶家族、信号转导系统、凋亡相关基因、氧自由基、Ca2+ 、NO、能量代谢、线粒体都参与了凋亡的发生线粒体与细胞凋亡间存在着密切关系，这在疾病的发展中起着十分重要的影响，因此对线粒体损伤的检测也有非常关键的意义。
1 mtDNA损伤及其修复
1.1 ROS 对mtDNA的氧化损伤
人类mtDNA编码维持细胞电子传递链和A TP生成等生理活动所必需的13 种多肽、22 种转运RNA(tRNA) 和2种核糖体RNA( rRNA)。mtDNA遭受氧化应激，将导致解偶联蛋白2 (UCP - 2) 基因、电位依赖性阴离子通道1(VDAC - 1) 、PRDX3 基因和Raf 基因等基因的受损，使其蛋白表达发生改变。因而，一旦mtDNA受到不可修复的氧化应激，将导致线粒体呼吸链的中断、膜电位的崩溃和A TP合成障碍，导致细胞凋亡。即ROS 可导致mtDNA损伤,mtDNA损伤导致线粒体多肽表达改变，继发电子传递链功能下降,A TP 生成减少，线粒体膜电位下降,ROS 生成增多，细胞素C 和凋亡诱导因子(AIF) 的释放，最终导致细胞死亡。Gonzalo R 等认为,mtDNA的突变影响了线粒体复合酶Ⅰ的活性，从而经电子漏生成的O2-会显著增多，使线粒体ROS 过量产生，而抗氧化酶的活性没有改变，从而导致线粒体内脂质和mtDNA的氧化加强。
1.2 mtDNA损伤修复
mtDNA损伤包括DNA单链断裂、双链断裂、碱基修饰、DNA链间交联等。修复是指DNA化学组成和核苷酸序列重新恢复的一种过程。mtDNA中碱基切除修复最为普遍，并辅以其他方式修复多种损伤。如通过尿嘧啶DNA糖苷酶、AP 核酸内切酶、DNA聚合酶和连接酶等完成尿嘧啶和无碱基位点修复；利用甲酰嘧啶DNA糖苷酶、8 - oxodGDNA糖苷酶(mtODE) 、腺嘌呤DNA糖苷酶(ADG) 和h Mutγ(变位
酶γ) 等对mtDNA氧化损伤进行修复；还有转换修复、错配和烷化损伤的修复以及重组修复等。如链内交联被认为是通过重组修复机制修复，酵母线粒体光合酶利用光使DNA中紫外光诱导产生的环苯嘧啶二聚体单体化，大鼠肝脏线粒体O6 -甲基- 鸟嘌呤DNA甲基转移酶切除mtDNA中O6 - 甲基- 2′- 脱氧鸟嘌呤，一些试剂如链尿菌素、亚用于基因特异分析中证实了mtDNA烷化损伤的特异性切除，但线粒体缺乏核苷酸切除修复机制。有人已利用一些纯化酶，如UDG、AP 内切酶、DNA聚合酶和连接酶等构建了mtBER 机制，并用于检测不同DNA损伤和揭示线粒体修复的生化机制。弄清什么类型DNA修复蛋白存在于线粒体，如何调节、如何抵达线粒体等已不十分遥远，这无疑对线粒体疾病的基因有重要意义。
2线粒体损伤与细胞凋亡
手冢治虫怎么读线粒体在细胞凋亡中的作用包括：释放Caspases激活因子如Cyto-c；丧失电子转移功能并减少能量的产生；线粒体跨膜电位的消失以及与BCL-2蛋白家族促凋亡和抑制凋亡功能相关
等方面。实验证明,γ辐射、Ceramide(凋亡信号转导中的重要分子，介于促凋亡信号和凋亡过程之间)、Fas与配体结合等均可导致线粒体在电子转移方面功能的紊乱，从而影响呼吸链,A TP产量下降。这种能量代谢上的障碍主要发生在细胞凋亡的晚期，线粒体在细胞凋亡过程中最重要的一点在于它可释放能够激活Caspases的蛋白。从线粒体释放的Cyto-c与Apaf-1、Procaspase 9结合在一起形成“凋
亡体”，其结果是Caspase 9的激活。除Cyto- c之外，线粒体还可释放其他介导细胞凋亡的分子:Procaspase 3和AI(Apoptosis-inducing factor)。AIF 在体外可作用于Procaspase 3，并且其本身可能就是一个Caspase。线粒体发生上述改变的机制在于线粒体膜上一种叫PT通道(Permeability transiton pore)的形成。促凋亡信号会使Caspases激活、胞浆Ca2+水平升高、产生Ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发PT 通道。PT通道是由线粒体一些内膜外膜蛋白组成的，定位于内外膜接触点，并可以无选择性地允许≤1.5kD分子通过。这个通道的开放会由于线粒体基质内的高渗透压，使线粒体内外H+梯度消失，呼吸链脱偶连，能量产生中断；还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜破裂，释放出包括Cyto-c在内的各种活性蛋白。线粒体在细胞凋亡中的重要性还在于它与Bcl-2基因家族之间的关系。实际上，很多Bcl-2家族的蛋白如BCL-2、BAX、BCL-XL等都定位于线粒体膜上。而且实验证实,BCL-2家族蛋白可以影响PT通道开放及其Cyto-c、AIF的释放，还可以改变线粒体外膜的通透性。如BAX一方面可以直接促使线粒体膜内的大小约为12kD 的Cyto-c在外膜未被破坏的情况下通过某种通道释放至胞浆；另一方面，又可以激发PT通道的开放。而BCL-2蛋白则起抑制作用。线粒体及Cyto-c在细胞凋亡中的中心地位虽然在不同信号诱导的细胞凋亡中不一定具有普遍意义，但线粒体作为细胞内死亡信号的感受者和放大者在细胞凋亡中的重要性是勿庸置疑的。
3线粒体损伤的病理生理变化
线粒体受损后的病理变化主要是形态的改变、膜电位的改变、对Ca2+ 通透性的改变、膜磷酯减少以
及氧化磷酸化解偶联等。脂质过氧化作用可使膜酶受到损伤、膜的通透性增加、膜受体失活、膜的流动性下降, 正常难以透过的物质如Ca2+ 的通透性增加, 而膜对Ca2+通透性的增加可进一步加重氧自由基对线粒体膜的损伤[5]。线粒体膜系统的损伤可导致线粒体氧化磷酸化功能的丧失。线粒体内膜通透性小，内膜上存在一些载体蛋白可以运输一些物质, 质子泵存在于内膜, 可将基质内质子泵入外室, 这样就形成了线粒体内膜跨膜电位。跨膜电位内室为负外室为正, 当线粒体膜因脂质过氧化作用受损后, 线粒体内膜跨膜电位下降, 线粒体在调节细胞内Ca2+浓度上起着至关重要的作用, 它可以通过多种机制吸收和释放Ca2+ , 在细胞内Ca2+超载时线粒体摄取胞浆中的Ca2+。在脂质过氧化时由于线粒体膜受损可导致Ca2+的通透性增加从而导致细胞的死亡, Ca2+ 通透性的增加还可导致氧化磷酸化的解偶联, 钙诱导的解偶联可被脂质过氧化抑制剂所控制。
4线粒体损伤的检测方法
条子生4.1MPTP，膜磷脂，膜电位检测
对受损线粒体的检测包括对线粒体渗透转换孔(mitochon2dria permeability transition pore , MPTP) 的检测、膜磷脂的检测、及膜电位的检测等等。MPTP是线粒体渗透转换功能的结构基础, 是环孢菌素A敏感性通道, 是线粒体内外膜结合处的一种蛋白性通道。MTPT 对细胞内多种离子浓度变化非常敏感, 特别是对在细胞内信号传导系统有重要作用的Ca2+ 的浓度变化敏感, MPTP的大量开启能引起膜电位
的崩解并导致细胞的凋亡。MPTP的检测方法有活性物质标记法、膜片钳法、分光光度法等, 其中分光光度法较为简单易用。脂质过氧化作用可以导致膜磷脂的减少, 对线粒体膜磷脂的检测对判定线粒体功能具有重要意义, 对差速离心法分离出的线粒体膜磷脂可采用高效液相谱进行检测，也可用毛细血管电泳联合荧光显微镜技术检测。受损线粒体膜电位的变化可采用膜片钳技术进行检测, 也可采用荧光探针的方法测定。
4.2mtDNA损伤检测三字格成语
(1)DNA测序是检测mtDNA序列多态性最常用的方法之一，该方法具有准确度高、结果稳定等特点。直接测序被认为是检测单核苷酸多态性和突变的金标准，但是其敏感性有限，异质性> 20%时，直接测序才可以检出。
(2)序列特异性寡核苷酸探针分析通过对基因特异性的寡核苷酸探针与基因的杂交的情况可以判定基因是否突变。序列特异性寡核苷酸探针分析技术有操作简单、灵敏性高、特异性好等优点，但目前所用基因座较少，系统的个人识别能力有限是其局限性。
(3)限制性酶切片段长度多态性分析是先将靶基因相关片段用PCR扩增，然后限制性内切酶能够特异性地识别特定的碱基序列对扩增产物片段进行酶切，通过电泳可将酶切片段分离检测。
练习模式
(4)单链构象多态性DNA分子在凝胶电泳中的泳动速率除取决于其相对分子质量的大小外，还受到空间构型的影响。当单链DNA分子中存在由于各种突变导致其核苷酸序列的微小变化时，这些变化会影响DNA分子的构象，从而使其在凝胶电泳中的泳动速率发生改变。因此，从泳动率的改变可以检测到基因突变。该技术具有简单、快速、敏感性高、需要样本量少、适合大量样本筛选等优点。
(5)变性梯度凝胶电泳是一项根据DNA解链特性分离鉴定DNA片段的技术。变性梯度凝胶电泳需要制备新鲜的梯度胶，检出率也较低，且只能确定突变的存在，不能进行突变位置和性质的定量分析。但变性梯度凝胶电泳无需知道待测片段的DNA序列，无需制备测试引物。
(6)变性高效液相谱技术是一种新的高通量筛选DNA序列变异的技术，其利用离子对反向高效液相谱原理，通过一个DNA分离柱进行核苷酸片段的分离和分析。该方法具有自动化、快速、检出率高、检测DNA片段大小范围广等优点。然而,DHPLC也存在一些缺点: ①不能检测纯合突变; ②只能提示突变的存在，无法确定具体的错配类型及位置; ③许多片段有多个主要解链温度，需要筛查的温度点较多，增加了工作量。
(7)实时荧光定量PCR技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。此法可快速定量检测异质性mtDNA，比多态性分析检测低频率突变体更为精确。
(8)其他基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱、基因芯片等检测碱基变异的方法也都可以用于mtDNA异质性的检测。
5结束语
综上所述, 线粒体是细胞能量的主要来源, 对维护细胞正常生理功能起着重要作用。线粒体与氧自由基的产生、细胞死亡进程的调控有关。许多毒物可以通过脂质过氧化作用对线粒体膜、膜蛋白及线粒体DNA造成损伤, 线粒体损伤和功能障碍与许多疾病的发生有密切关系。这种损伤往往发生在对能量要求较高的处于有丝分裂的组织如心肌、大脑等。因此对线粒体结构功能损伤的检测, 特别是从亚细胞和分子水平研究线粒体损伤的结构功能变化, 对阐明与线粒体受损有关的细胞功能障碍及疾病的发病机制有着重要的意义。
线粒体膜电位的降低是凋亡的一个早期事件，
5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1)可用于流式细胞术检测线粒体膜电位的变化。正常细胞的线粒体膜电位电压较高，可形成JC-1的聚集体，发出红荧光，而线粒体膜电位降低的细胞，则会形成JC-1单体，发出绿荧光。材料：细胞悬液完全细胞培养基去极化药物：如0.1mM valinomycin或0.25mM carbonyl cyanideacm
m-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) in DMSO 1mg/ml JC-1储存液（溶于DMSO），分装成小包装，在－20℃可保存1年。PBS 具有488nm激发光源的流式细胞仪，配备525－590nm带宽的滤镜。JC-1染：
收集2105的细胞，用预温到37℃的新鲜完全培养基调整至1ml。制备阳性对照（以去极化药物处理过的细胞）。标本和阳性对照的染步骤相同。融化1管JC-1储存液，每1ml细胞悬液中通过边振荡边加的方式加入2.5L（终浓度：2.5ug/ml）。振荡细胞悬液直至标本形成均一的红紫。JC-1在水相容易形成聚集体，所以需要边振荡边加。未用完的JC-1不要再保存至－20℃。37℃避光保存10分钟。加入2ml PBS至细胞悬液中，500g室温离心5分钟，去上清。以0.3ml PBS重悬细胞。上机取样，注意获取细胞的速度不要250至300细胞/秒。Fig1 HL-60 cells, (A) control and (B) depolarized (treated with 100 nM valinomycin), stained with 2.5 g/ml JC-1. Note the shift to the bottom and to the right by cells with depolarized mitochondria.Fig2 After incubation with 2.5 g/ml JC-1 at 37C, peripheral blood mononulear cells usually show a single population of monocytes, while here lymphocytes give rise to two separate peaks. This could indicate the presence of a functional heterogeneity within lymphocytes (A). Such a phenomenon, however, is not always present. Treating cells with valinomycin results in a loss of orange signal either from lymphocytes or from monocytes (B).
Bax诱导的凋亡―――线粒体穿孔而死亡
Bax是一种Bcl-2家族的前凋亡蛋白，一般出现在胞浆中，并作为一种细胞损伤和刺激的传感器。响应损伤和刺激，Bax将重新定位于线粒体表面并破坏在正常状态下抗凋亡的Bcl-2蛋白的功能。一般来说，在胞浆中的Bax以单体形式存在，然而在细胞发生凋亡时，与线粒体关联的Bax既可能以无活性的单体形式存在，也可能以与线粒体膜结合的大分子量的活性复合物形式存在。Bax可以构成跨线粒体外膜的孔，并导致膜电位的降低和细胞素C（Cyt C）及凋亡诱导因子（AIF）的外流，细胞素C与Apaf-1和ATP及pro-Caspase-9形成复合物（凋亡体）并导致Caspase-9的激活。与细胞素C的结合使Apaf-1与pro-Caspase-9的结合能力更强。虽然Apaf-1的N端有一个Caspases 1，2，3，4和9所共有的CARD（Caspase Recruitment Domain）域，但由于Apaf-1没有任何Caspase活性，因此可以认为pro-Caspase-9在凋亡体中通过自身酶切反应而被激活。在此机制中，抗凋亡分子Bcl-2及Bcl-X L起阻止线粒体上孔的形成的作用，当Bax
与Bcl-2或Bcl-XL时形成异源二聚体时，它就阻断了这些分子的抗凋亡作用。BCL-2基因概述:
自从1972年Kerr提出细胞凋亡（appoptosis）的概念至今，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究。但是，凋亡的分子和生化机制迄今尚未彻底明了；而已形成的初步认识大多源于对Bcl-2基因家族的研究。已知，调亡进程可分为三个时相：诱导期，效应期和降解期。在诱导期，细胞接受各种信号从而引发各种不同的效应：进入效应期后，经过一些决定细胞命运（存活/死亡）的分子调控点，细胞进入不可逆的程序化死亡，这些调控分子包括一系列原癌基因和抑制癌基因的产生，其中Bcl-2家族
起着决定性的作用；降解期则产生可见的凋亡现象。
Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并用近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是象Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、线虫Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri。次同步谐振
最初在血液淋巴细胞中发现Bcl-2能抑制细胞死亡，随后陆续在其它一些细胞中也发现Bcl-2的这种作用。但近年来研究发现，除些之外尚存在Bcl-2不敏感的凋亡途径。
Bcl-2敏感的凋亡途径
Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡。Bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒因素的抵抗性。这一发现使人们认识到凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路或交汇点，而该通路或交汇点受Bcl-2调节。实验表明，Bcl-2可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性，抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡，但其本身并不能抑制这些因素对细胞的损伤；同样地，它也不能促进DNA修复。p53蛋白是DNA损伤的一个分子传感器，已证实Bcl-2能抑制p53介导的凋亡，但不能抑制
p53向核内转位或者p53介导的生长停滞，可能Bcl-2的作用是在DNA损伤后，阻止激活凋亡机制的信号到达其靶分子；在细胞毒性T细胞中，由颗粒酶B激活Caspases家族的一个或多个半胱氨酸蛋白酶所诱导的凋亡不依赖于Bcl-2，颗粒酶B可能仅作用于凋亡路径中Bcl-2调节位点的下游。以上结果表明在凋亡途径中Bcl-2的作用位点在信号分子和效应蛋白酶之间的位置。
Bcl-2抑制细胞凋亡可能与其以下几种作用有关：
① 细胞催抗氧化作用以往研究表明，在去除生长因子所诱发的凋亡中，活性氧损伤（ROS）是促发细胞死亡的主要诱因：Bcl-2的过度表达可减少氧自由基产生和脂质过氧化物的形成。提示Cai等[4]的实验表明Bcl-2的抗氧化作用是间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧。细胞素c（cytochrome c, Cyt c）作为呼吸链中重要的电子传递
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