线粒体DNA是线粒体中的遗传物质，线粒体能为细胞产⽣能量（ATP），是在细胞线粒体内发现的脱氧核糖核酸特殊形态。⼈类的线粒体基因DNA（mtDNA）是长度为16569bp的双链闭合环状DNA分⼦，序列可分为编码区和控制区两个部分。其中，编码区较为保守，共37 个基因编码多种RNA 和蛋⽩质。控制区变异率较⾼，根据其在基因组上的位置，通常将其分为三个区域：位于线粒体DNA 链16024~16365 bp 的⾼变1 区 (hypervariable region Ⅰ , HV Ⅰ )，位于
73~340 bp 的⾼变2 区(hypervariable region Ⅱ , HV Ⅱ )，以及位于340~576bp 的⾼变3 区 (hypervariable region Ⅲ， HV Ⅲ )。具有母系遗传、多拷贝、⾼异质性及⾼变异率等特点。 菱形
摘要
⽬标：基于线粒体基因组的独有特性以及线粒体转运RNA（mt-tRNA）的保守结构和功能特点，本研究根据我们实验室三⼗多年的临床经验，建⽴了mt-tRNA基因变异解读的标准。
⽅法：通过⽂献复习，我们筛选出所有已知明确致病（Pathogenic, P）和良性（Benign, B）变异，并分析了各个变异的异质性⽔平与表型、组织分布、家庭成员和⽆⾎缘关系家系之间的相关性，在此基础上建⽴了⼀套规则。然后我们⽤已知变异的新案例检验了上述规则，并最终将其应⽤于未报导过的变异的评级分类。
结果：通过对已报导的致病变异的评估，我们发现80.6%的变异有⾜够的证据⽀持家族间和家族内表型与异质性⽔平的相关性。其余的由于缺乏此类证据，以⾄被降级。通过应⽤已验证的标准，80.8%已报导的致病性未明(VUS)变异重新被评定为良性和可能良性。在97个新变异中，没有⼀个符合P的标准。⼤部分（84.5%）新变异仍然被评定为VUS，只有10.3%是可能致病变异。如果这些新变异在更多个体中检测到，数据的积累将有助于变异更好的解读。 结论：Mt-tRNA变异的恰当解读和分类对临床精准诊断和遗传咨询⾄关重要。异质性⽔平、组织分布、对tRNA结构功能影响的软件预测以及临床表型等均是评判Mt-tRNA变异临床意义的重要证据。
关键词：mt-tRNA变异解读；tRNA变异分类标准；MitoTIP
引⾔
由于线粒体DNA (mtDNA)或核基因(nDNA)缺陷均可导致线粒体功能损伤，线粒体病的临床表现多变且遗传⽅式各异1。因此，为线粒体病作出明确的分⼦诊断⼗分具有挑战性2。⽬前已知⼤约有250-300个编码线粒体结构/功能蛋⽩的核基因缺陷会导致线粒体疾病的发⽣3。这些核基因变异的分类可依据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)发布的遗传变异分类标准与指南4。然⽽，如果要将该ACMG指南应⽤于mtDNA变异的解读，则需⾸先根据mtDNA的独有的遗传特点对其规则进⾏修改。这些特点包括不同细胞和不同细胞类型中mtDNA数量的不同、在⼦代细胞随机分离、异质性、不同⼈体
组织对能量的需求不同、线粒体分裂/融合的平衡、阈值效应、母系遗传、瓶颈效应和由于在快速分裂的细胞中优先消除有缺陷的线粒体基因⽽导致的组织/年龄相关性异质性差异1,5,6。
线粒体转运RNA (mt-tRNA)基因仅占整个线粒体基因组的8%左右7。但是，根据相应编码区的总长度，mt-tRNA基因中致病变异发⽣的频率明显⾼于(~8.5×)线粒体信使RNA (mt-mRNA)7。因此，mt-tRNA变异是导致mtDNA疾病的主要原因。标准的mt-tRNA的经典⼆级结构形似三叶草，包含四个茎和三个环8。从双链mtDNA转录⽽来的两个多顺反⼦前体转录本经过在特定核苷酸位点的切割以及转录后修饰，进⽽形成成熟的mt-tRNAs9。每个mt-tRNA通过其特异性氨酰基-tRNA合成酶(mt-ARS)进⾏氨酰化10。任何破坏mt-tRNA结构、加⼯过程、转录后修饰、氨酰化和密码⼦识别的变异都可能影响线粒体功能。因此，对mt-tRNA变异的分类解读必须充分考虑mt-tRNA的结构/功能和线粒体基因组的特征。
在本研究中，我们回顾了之前已报导的mt-tRNA变异并提取了分类的条件和⽅法。然后，我们应⽤这些规则对已报导的致病性未明变异(VUS)和新的mt-tRNA变异进⾏了分类。
材料和⽅法
制定和验证mt-tRNA变异分类的标准
从2005年到2016年，我们在Baylor College of Medicine 和Baylor Genetics 的线粒体分⼦诊断实验室检测出⼤约10,000个mtDNA变异。去除⾼频(>5%)线粒体单核苷酸多态性(mtSNPs)后，剩下总共550个mt-tRNA变异，其中有97个新变异和453个既往报导过的变异。根据已发表的⽂献(图1）和附表1;“已报导”列)，453个已报导变异可被分为致病(P)、致病
www.ddd13和453个既往报导过的变异。根据已发表的⽂献(图1）和附表1;“已报导”列)，453个已报导变异可被分为致病(P)、致病性未明（VUS）和良性(B)变异。为到这453个变异的致病性证据，我们进⾏了相关⽂献复习。我们根据有充分证据⽀持的明确的P和B变异，推导出了分类标准（附表1；“添加新病例前评估”列）。然后，通过对已知变异新病例(附表
1；“添加新病例后重新评估”列)的分析，我们验证和优化了这些分类标准。随后，我们应⽤已调整和验证后的标准重新评定已报告的证据不⾜的P和B变异，并应⽤这些标准(表1、2，见⽂末)重新分类已报导过的VUS变异和新变异(图1)。变异的分类联合标准同ACMG指南4。
图1. 线粒体转运RNA(mt-tRNA)变异解读流程图
B良性的，LB 可能良性的，LP可能致病的，mtDNA 线粒体DNA，mRNA 信使RNA，rRNA 核糖体RNA，P 致病
的，SNP单核苷酸多态性，VUS 致病性未明变异。
MitoTIP评分的应⽤
表1. mt-tRNA致病变异分类标准
左列为ACMG分类标准，右列为mt-tRNA变异的新分类标准。
ACMG 美国医学遗传学与基因组学学院，ATP 三磷酸腺苷，COX 细胞⾊素C氧化酶，ETC 电⼦传递链，mt-tRNA 线粒体转运RNA, NGS ⼆代测序，OCR 耗氧率，PCR 聚合酶链式反应。
表2. 良性变异的分类标准
左列为ACMG分类标准，右列为mt-tRNA变异的新分类标准。
ACMG 美国医学遗传学与基因组学学院，mt-tRNA 线粒体转运RNA
结果
评估已报导的mt-tRNA变异
已报导过的变异有453个。在既往⽂献报导中，将453个已知变异分为72个P变异、261个VUS和120个B变异(图1，见⽂末)。通过⽂献复习，我们发现在72个已报导的P变异中，仅40个有充分证据⽀持其
致病性。证据当中的决定因素包括与异质性⽔平相关的功能研究(PS3)，多个已报导病例⽀持其致病性 (PS5)，MitoTIP评分>16 (PM7)，变异的异质性⽔平>5%且与同⼀个患者不同组织分布情况相关（PM8），或与不同母系家族成员/独⽴家系不同患者的临床表型轻重程度⼀致（PM9）。其余的变异缺少⼀个或多个此类证据(附表1)。
⽤我们的新病例验证和确认既往评定为P的变异
变异致病性的主要证据是功能实验研究结果(PS3)和变异的异质⽔平与⽣化、细胞或临床表型的⼀致性(PM8, PM9)。对于所有的新变异，单独的PS3证据不是评定P变异的充分证据。例如，m.5540G>A(MT-TW)和m.8362T>G(MT-TK)都报导了⼀个病例，有功能实验，但没有任何临床相关性的证据。在⼀名患有进⾏性脑病的36岁⼥性中检测到异质的
m.5540G>A变异(PP4,PP6)12。单纤维分析显⽰肌纤维线粒体功能障碍程度与该变异的异质性⽔平(PS3)相关。根据该报导，我们将m.5540G>A评定为可能致病的（LP，在“新增病例前评估”列）（PS3 +PM7 + 2PP)（表3，见⽂末）。我们发现⼀名新的携带此变异的脑肌病患者，其⾎液中变异异质性⽔平为25%，⽽肌⾁中达到了51%(PM8)。患者⽆症状的母亲没有携带该变异(PM9)。这个新的案例增加了两个PMs等级的证据，使m.5540G>A的致病性分类升级为P。
变异m.616T>C （MT-TF）和m.15915G>A（MT-TT）均分别被报导过两次，其异质⽔平与临床表型
⽆相关性（缺乏PM8证据）。例如，m.616T>C曾被报导于⼀个严重癫痫患者13。在先证者的多种组织中该变异⼏乎是同质的，⽽在⽆症状的母系亲属的⾎液和⼝腔拭⼦中却是异质的。另外两个携带m.616T>C变异的家系表现为肾⼩管间质性疾病14，该变异在所有患者的⾎液中都是同质的。功能实验证实了这些患者的线粒体功能障碍，但功能改变程度与异质性⽔平的相关性并不明显(PM10)。由于不同患者临床表型的不⼀致性，该变异只能被评定为LP (PM7、PM9和PM10)。我们检测到该变异在⼀位患有癫痫和肾⼩管病的患者⾎液中为同质的，⽽在患者的⽆症状母亲的⾎液和肌⾁中分别为89%和86%。这个新病例表明该变异可能在不同的组织中具有较⾼的表型阈值，并且⼤致同质的变异需要⽤精确的⽅法对异质程度进⾏定量15。PS5的加⼊增强了该变异的致病性证据(表3，见⽂末)
将既往报导的P变异降级为LP
将既往报导的P变异降级为LP
⼤多数被降级的P变异缺乏功能实验证据(PS3)，这也是致病性最重要的决定因素（表3，见⽂末）。例如，m.4296G>A (MT-TI)变异曾在⼀名Leigh综合征患者中发现并报导16。该变异在先证者的⾎液和成纤维细胞中异质性⽔平分别为78%和85%，在⽆症状的母系亲属中低于5%。然⽽，在第⼀篇报导⾥，检测异质性⽔平的⽅法是扩增阻滞突变系统定量聚合酶链式反应(ARMS qPCR)。由于引物与靶序列的结合可能因靶存在变异⽽影响其扩增效率，ARMS qPCR的准确率不如基于mtDNA环扩增产物进
⾏的深度下⼀代⾼通量测序（NGS)。在先证者的⼈⼯培养的成纤维细胞⾥，电⼦传递链复合物(ETC)活性显⽰复合物I+III和复合物IV的活性分别为正常⽔平的33%和30%。但如上⽂所述，与异质性⽔平⽆相关性的单独ETC活性检测不能满⾜PS3证据。最近，我们在另⼀名患者的⾎液中检测到了m.4296G>A变异，异质性⽔平为2%。同时该患者的mtDNA有⼀个⼤⽚段缺失，异质⽔平为64%，该缺失很有可能就是导致该患者线粒体疾病的原因。综上，⽬前的证据尚不⾜以⽀持m.4296G>A的致病性，我们将该变异降级为LP变异 (3PM)。这个案例促使了PM10证据的创建和BP5证据的完善 (患者携带第⼆种变异可解释其疾病)。
m.1624C>T （MT-TV），m.14674T>C （MT-TE）和m.14709T>C（MT-TE）等三个变异被降级为LP，因为先证者和⽆症状母亲的体内均检测到这些变异为同质性。例如，同质性的m.1624C>T变异在⼀个有严重线粒体疾病的家系中被报导，该家系中有1名⼉童患有Leigh综合征，6名新⽣⼉死亡（PP4）17。mt-tRNA Val的稳态⽔平以组织特异性的⽅式显著降低（PS3）18。根据MitoTIP评分，该变异位于⼀个重要的结构位置（PP3）。但是，⽆症状母亲也携带同质的m.1624C>T，该变异的异质性⽔平与不同个体表型的差异不⼀致。因此，m.1624C>T的致病性尚有待商榷（综合标准=1PS + 2PPs = LP）。
将既往的P变异降级为VUS
我们将10个已报导的P变异降级为VUS，因为它们是第⼀次被报导，并且缺乏功能实验或者没有异质性与表型相关的证据（缺少PS3和PM8/PM9）。我们的新病例没有提供⽀持致病性的证据。因此，这些变异仍保持是VUS （表3，见⽂末）。例如，m.1643A>G (MT-TV)变异以前报导于⼀名脑病患者19。该变异的MitoTIP评分为11.9，未达到PP3。该变异在报导中被描述为在先证者中⼏乎同质，⽽在⽆症状母亲中是异质。然⽽，该报导中的PCR/RFLP分析显⽰
m.1643A>G在先证者和母亲的⾎液中均接近同质性。因此，该变异异质性⽔平与其临床表型不⼀致。我们在⼀位患者的⾎液中检测到了此变异，但异质⽔平仅为1.8%，因此并不能解释其表型。如果没有异质性⽔平和表型相关性的证据，我们⽆法证实该变异的致病性，因此它被降级为VUS（PM10+ PP6）。
表3.原报导为致病变异但重新评估后分类不⼀致的mt-tRNA变异
imrt
ACL 反密码⼦环，ACS反密码⼦茎，AS 接纳茎，B良性的，C1 连接体1，C2 连接体2，DB 识别位碱基，DL D
环，DS D茎，LB 可能良性的，LP 可能致病的，mt-tRNA 线粒体转运核糖核酸，P致病性的，TL T环，TS T茎，VR 可变区域，VUS 致病性未明变异
a唯⼀升级到LP的VUS。
将既往的P变异降级为B或LB
m.3236A>G (MT-TL1)、m.4381A>G (MT-TQ)和m.15926C>T (MT-TT)等三个变异在既往报导中被分类为P变异，但它们都是在⼤型队列研究中发现的，没有做任何功能实验，后续⼜在公共数据库的多个健康个体中被检测到20-22。因此我们将这些变异降级为良性变异。同样的，我们在⽆症状的母亲中检测到m.3275C>A (MT-TL1)，结合其MITOMAP收录情况，该变异被评定为LB变异23。
乙酸乙酯实验装置重新评估既往的VUS
我们重新评估了261例已报导的VUS(附表1)，其中⼤部分（81%）分类为LB（78/261 = 30%)或B（133/261 = 51%）变异，剩下49例仍为VUS。基于我们数据库的⼀例新病例，我们将m.12148T>C(MT-TH)变异由VUS升级为LP变异。该变异的MitoTIP得分是16.2。根据Sanger测序结果，该变异在先证者中是异质的，但在先证者的母亲和妹的⾎液中未检测到。在先证者母亲的尿液中该变异的异质⽔平为10.2%。因此，m.12148T>C变异被评定为LP（PM7、PM9、PP4和PP6）。⼤部分VUS被分类为LB或B变异是因为它们在公共数据库中被报导为多态性(BS1)，或在我们的数据库中的多个健康成⼈（BS2)和/或⽆症状母系亲属(BS4)中被检测到为同质变异。
重新评估既往的B变异
我们重新评估了120个以前被报导过的良性变异。基于有冲突的证据，只有⼀例(m.5793A>G[MT-TC])被升级为意义不明的变异。该变异以前被报导为多态性22。然⽽，其MitoTIP得分为14.9 (PP3)。我们在患有Leigh综合征的先证者的肌⾁中发现该变异为低异质性(PP4)。因此，m.5793A>G变异被评级为意义不明的变异。由于⼤部分以前被评级为良性的变
中发现该变异为低异质性(PP4)。因此，m.5793A>G变异被评级为意义不明的变异。由于⼤部分以前被评级为良性的变异在公共数据库(BS1)被报导为多态性，并且在我们的数据库中的健康成⼈体(BS2)或⽆症状母系亲属体(BS4)中被报导为同质性变异，因此它们仍被评级为可能良性的(6/120)或良性的(113/120)变异。
解读新的mt-tRNA变异
我们评估了97个新变异，其中10个被评定为LP(表4，见⽂末)，82个被评定VUS，5个被评定为LB，0个被评定为B(附表1)。由于缺乏异质性⽔平与线粒体功能(PS3)的相关性，且没有多个家系报导(PS5)的证据，没有变异被分类为P。⼤多数的新变异仍然是VUS。如果新变异的异质性⽔平与表型⼀致，它们通常会被评定为LP变异。对于新变异来说，最常⽤的致病性证据包括在公共数据库中和⽆症状的母亲上未发现该变异(PM2)，异质⽔平⾼低与表型⼀致
（PM8,PM9)，MitoTIP得分⾼（PM7,PP3），以及患者表型或家族史提⽰该疾病是线粒体病(PP4)。
例如，在⼀位先证检测到⼀个新变异m.578T>C (MT-TF)，该变异在⾎液中异质程度为16%，但在⽆症状母亲未检测到该变异(PM2, PM9, PP6)。该变异的MitoTIP评分为16.6 (PM7)。因此，该变异被评级为LP变异 (3PM, 1PP)。另外⼀个新变
异，m.4372C>T (MT-TQ)，在先证者的⾎液中异质⽔平为22.8%，在⽆症状母亲未被检测到该变异(PM2, PM9, PP6)，其MitoTIP评分为15.8 (PP3)。因此，我们将该变异评定为LP变异 (2PM, 2PP)。
当新变异为同质性，并且在健康成⼈中出现多于3次(BS2)，或在⽆症状母系亲属中出现超过2次(BS4)，以及没有表现出结构保守(BP4)时，该新变异可以被评级为可能的变异。LB变异在新变异中很少，因为⼤部分良性变异已在⼤规模公共数据库中出现过，并被过滤了。
讨论
致病性评估的关键因素
2008中秋晚会在系统复习了已报导的mt-tRNA基因的致病变异后，我们观察到19.4％的变异没有⾜够证据⽀持其为P或LP。主要原因是早期发现的变异往往被过度的评定为致病变异。由于数据的缺乏，⼤多数新发现的变异仅被检测到⼀次或很少的次数。另⼀⽅⾯，以前⽤于分析变异异质性⽔平的测序和定量技术尚不完善。此外，以前低效的测序⽅法使⼤量的候选核基因未被检测，这导致了对mt-tRNA基因致病性的
误判。随着测序和定量技术的进步，现在可以精确检测变异，同时对其异质⽔平进⾏定量15,24，进⽽提供更好的分⼦缺陷和异质性⽔平与临床表型的相关性。此外，肌⾁病理中线粒体特异性改变可能是由于之前未发现的核基因⽽⾮mtDNA变异所导致的。经验的积累和不断增加的病例使我们能更好地解读既往报导的变异的致病性。因此，10到20年前的新发现或罕见的变异可能需要被重新解读。
变异降级的⼀个重要原因是该变异在⽆症状母亲中表现为⾼异质性⽔平（例如m.14709T> C）或同质性（例如
m.14674T> C，m.3250T> C，m.4290T> C）。母系遗传，表型阈值效应和异质性是线粒体基因变异特有的主要特点。另⼀个致病性评分降低的常见原因是缺乏与变异异质性⽔平相关的功能研究(PS3)。
变异未在公共数据库中的报导过对于评估其致病性⾮常重要。由于mtDNA具有⾼度多态性，并且线粒体基因组的⼏乎每个核苷酸位点都有mtDNA变异被发现[5,25]，⼤多数的良性变异已经被发现。因此，新变异很显然是罕见的，并且更可能是致病的。所以，我们将“在⽆症状母亲中未检测到的新变异”定为中等程度的致病性证据（PM2）。若不知母亲是否携带该新变异，则为⽀持性证据（PP7）。另⼀个重要因素是下⽂要讨论的结构保守性。此外，我们发现mtDNA拷贝数⽔平也可能是mt-tRNA缺陷的指标。我们⾄少有三个具有mtDNA拷贝数信息的家系。其中⼀个具有正常的mtDNA含量（m.437
2C> T [MT-TQ]，肌⾁中97％）。但是，其他两个（m.10460T> C [MT-TR]和m.12335T> C [MT-TL2]）mtDNA 扩增⾄⼤约300％（三倍升⾼），⽽肌⾁中的ETC分析显⽰复合体功能缺陷。两个变异都被评定为LP变异，因为“新”变异都需要第⼆个病例的确认才可能升级到P（表4（见⽂末），附表1）。
表4. 可能致病的新变异
ACL 反密码⼦环，ACS反密码⼦茎，AS 接纳茎，B良性的，C1 连接体1，C2 连接体2，DB 识别位碱基，DL D
环，DS D茎，LB 可能良性的，LP 可能致病的，mt-tRNA 线粒体转运核糖核酸，P致病性的，TL T环，TS T茎，VR 可变区域，VUS 致病性未明变异
MitoTIP评分
MitoTIP是⼀种新近开发的⽣信⼯具，可⽤于预测mt-tRNA基因新变异的致病性。MitoTIP评分是根据变异在数据库中的频率，MITOMAP的致病性注释，物种之间的保守性，变异所处tRNA序列结构的位置以及核苷酸变化的性质（颠换/置换/缺失）计算⽽来11。mt-tRNA与mRNA的重要区别在于它们的结构保守性，这使得mt-tRNA变异的致病性更适合计算机模拟预测。我们针对MitoTIP评分的⽔平的⾼低制定相应的中等和⽀持证据，以将结构保守性的重要性充分纳⼊变异评估过程中。
在⼤多数情况下，MitoTIP分数符合我们的最终分类；但是，我们也注意到有些离值。例如，最常见的致病变异
m.3243A>G的MitoTIP得分仅为13.3。这是因为该变异位于D臂环中，这不是⼆级结构中与疾病相关的常见位置。此外，MitoTIP并未考虑转录后修饰。更令⼈惊讶的是，反密码⼦三联体的关键核苷酸仅具有中等甚⾄低MitoTIP评分，范围从6.6到13.1。这是因为这些序列在tRNA结构中既不保守，也不存在于通常与疾病有关的保守⼆级结构中（反密码⼦环）。此外，具有低MitoTIP分数的P变异倾向于引起较轻的临床表现，且需要达到较⾼的表型阈值才致病。例如，尽管m.3242G>A紧靠最常见的m.3243A>G变异，但其MitoTIP得分较低，仅为7.0，在肌⾁异质性为94％时才会引起轻度线粒体肌病26。
核基因组背景可能会影响mt-tRNA变异的表达
与LHON相似，某些mt-tRNA变异⽆论在先证者还是⽆症状母亲的各种组织中均是同质的10。mtDNA复制，转录和翻译的机制均依赖于核基因组。尤其，对于mt-tRNA，转录后修饰和mt-氨酰基tRNA合成酶的功能均受核基因组调控27。因此，核基因组背景可以影响mt-tRNA变异的表达。例如，m.1630 A>G（MT-TV）是⼀个罕见变异，仅在两个家系中报导过：⼀个家系患有线粒体脑肌病伴⾼乳酸⾎症和卒中样发作（MELAS），另⼀个家系则患有线粒体神经胃肠型脑肌病（MNGIE）综合症28-30。尽
管⼤量的功能研究已证明其致病性，但该变异在先证者和⽆症状母亲中异质性⽔平均很⾼，这个现象与该变异的表型和致病性相冲突。我们最近的研究30应⽤全外显⼦测序技术，在先证者的线粒体缬氨酰tRNA合成酶（VARS2）基因中检测到⼀个⽆义变异c.1000C>T（p.R334X），⽽在其⽆症状的母亲中则未检测到，尽管该母亲在⾎液中携带m.1630 A>G变异的异质⽔平⽐先证者的更⾼。c.1000C>T（p.R334X）使蛋⽩阶段，导致VARS2C末端有三分之⼆的蛋⽩区域缺失，后者内正好包含与mt-tRNAVal相互作⽤的关键区域。因此，核基因编码的VARS2基因变异可能与MT-TV变异有协同作⽤。m.1630 A>G的致病性尚待更多的类似病例的进⼀步⽀持。
m.1624C>T是另⼀个类似的例⼦，其具体情况已在本⽂“结果”部分描述。为了将该变异升级为P，仍需发现能修饰其表型表达的因素（最可能是核基因变异）。其他可能受核基因组影响的变异包括m.3250T>C（MT-
TL1），m.14674T>C（MT-TE）和m.14709T>C（MT-TE）。
影响反密码⼦三联体关键核苷酸的变异
从理论上讲，引起反密码⼦替换的变异会⼲扰tRNA的解码过程，因此，它们很可能是致病的。然⽽，这种变异很少被报导，提⽰它们可能在胚胎形成或发育早期造成严重后果，导致胚胎⽆法存活。迄今为⽌，仅有四个这样的反密码⼦变异被报导，其中三个与严重的表型有关。例如，m.5545C>T变异（
MT-TW，UGA [⾊氨酸] 变为终⽌密码⼦UAA）会导致严重的多系统疾病31；m.10437G>A变异（MT-TR，GCU变为ACU [苏氨酸]）在⼀名16岁的线粒体脑肌病男孩中检测到32； m.14710G>A变异（MT-TE，CUU变为UUU[苯丙氨酸]）在⼀名41岁的患有线粒体肌病和视⽹膜病的⼥性中检测到33。但是，tRNA的解码过程是⼀个关键且复杂的过程，并且反密码⼦核苷酸可能不是密码⼦识别的唯⼀决定因素。例如，摆动修饰也可能影响密码⼦识别34。此外，由于氨酰基tRNA合成酶⽤于识别tRNA的鉴别碱基和tRNA的结构特性保持不变8，35，突变的tRNA可能仍具有部分能⼒来编码正确的氨基酸。这可以解释为什么异质⽔平为85％的m.15990C>T变异（MT-TP，UGG变为UGA）在先证者中仅导致了肌病36。有趣的是，m.3267A>G（MT-TL1，UUA 变为CUA）和m.12300G>A（MT-TL2，CUA变为UUA）的致病性可能很低，因为它们不会改变tRNA与亮氨酸密码⼦结合的能⼒。
异质性检测
准确检测异质性⽔平⾼低对于mt-tRNA变异的分类⾄关重要，对于建⽴临床诊断和准确的遗传咨询也很关键。以
前，mtDNA变异异质性的检测是通过各种基于PCR技术的⽅法实现的，包括针对常见热点变异的ARMS qPCR37和针对新变异的Sanger测序。然⽽，由于mtDNA的SNPs在整个线粒体基因组均有分布且频率很⾼，检测⽅法的局限性，以及qPCR中鉴别核苷酸的PCR偏倚37，这些基于PCR技术的⽅
法不能准确地定量异质性。2012年，我们建⽴了mtDNA 测序的⾦标准——长程PCR/⼤规模平⾏测序⽅法（LR-PCR/MPS），对扩增的环状线粒体基因组进⾏深度测序，同时定量和定性评估整个线粒体基因组的每⼀个碱基，并且不受mtDNA核同源序列(NUMT)的⼲扰15，38。
PS2和PM2证据仅针对使⽤这种可靠准确的⾦标准⽅法测得的异质性⽔平。PM8，PM9和PP6证据⾥的5％异质性的切割值是⼀个估计值，它是基于⼤量观察结果设定的。更多的经验和⽀持性证据有助于推导出更精确的切割值。
变异频率和对照⼈的使⽤焦亚硫酸钠
对照或正常⼈中某个变异的频率对于评估其致病性很重要。我们从公共数据库和私有实验室数据库中获得了等位基因的频率。现在MITOMAP显⽰的GenBank频率数据来源于48882个长度⼤于15.4 kb的⼈类线粒体DNA序列，其中47,248个既不来⾃癌症也不来源于古代DNA5。mtDB包含来⾃2700多个个体的mtDNA变异25。我们的临床数据库包含超过10,000多个完整的mtDNA序列。
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