姓名 施绘程
学号罗汉鱼天下 3100104825
课程名称 生物有机化学
指导老师 徐刚
专业 生物工程
酶法制备D-氨基酸进展
摘要：酶法制备D-氨基酸具有其他方法所不可比拟的优势。目前应用最广泛的是N-小说月报2012
乙酰-氨基酰化酶和D-海因酶手性拆分途径。氨基酰化酶可以用于生产多种不同氨基酸，海因酶途径副产物可以自发消旋化。对于这两种途径，目前的研究主要集中在通过改变反应条件提高酶的活性和选择性，以及通过固定化技术提高酶的生产率。 张希骞
1.概述
在自然界中已经发现了300种氨基酸中，虽然其中约有90%为L-型氨基酸，只有约10%为D-型氨基酸或其它氨基酸，而且D-型氨基酸不能构成重要的生物分子——蛋白质，但是近年来，随着科学研究的深入，人们发现许多植物、微生物和高等植物中都有D-氨基酸的存在，D-型氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构单元，但D-氨基酸同样具有非常重要的作用，D-型氨基酸所具有的特殊性质和功效是L-氨基酸不可代替的[1，2]。
D-型氨基酸在食品行业中主要用作甜味剂。D-苯丙氨酸、D-天冬氨酸和D-丙氨酸都是合成甜味剂的重要原料，其中D-丙氨酸本身就是一种强甜味剂。由于D-氨基酸及二肽在人体内
几乎不发生代谢作用，而且没有毒性，可以作为非营养性甜味剂，适于肥胖症、高血压以及糖尿病患者食用[3]。
在农业上，D-缬氨酸可用于合成新型高效农药拟除虫菊酯和氯氟戊菊酯，由D-缬氨酸与相应的醇经酯化而制得缬氨酸杀虫菊酯是一类广谱的很有发展前景的杀虫杀螨剂，能有效她防治棉花、果树、蔬菜等作物的包括鳞翅目和双翅目等在内的主要害虫。D-氨酸可以作为6-苯基腺嘌呤的合成前体，6-苯基腺嘌呤能够很好的刺激植物细胞和组织的生长，促进花芽的分化，提高作物的产量[2]。
多种D-氨基酸是合成成抗生素、抗糖尿病、抗癌、镇定、抗心血管疾病等多种药物的重要中间体。图1列出了目前医药市场上部分含有D-型氨基酸的药物及其临床应用。[1]
另外，D-氨基酸还可以应用于化妆品添加剂、染发剂等日用化学品中。
2.D-氨基酸制备方法
化学法生产D-氨基酸反应条件相对比较剧烈、污染大，产率低并且费用高，因此不适合大规模生产；由于D-型氨基酸属于非天然氨基酸，因此用发酵法制备D-氨基酸比较困难，得到的氨基酸光学纯度和产率都比较低。而于酶法具有拆分效率高、立体选择性高、反应条件温和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点，从而使得它在工业生产中具有很好的应用前景。
酶法制备D-型氨基酸，由于初始原料的不同又可以分为3种方法：⑴以消旋的DL-氨基酸为原料；⑵以消旋的DL-氨基酸衍生物为原料；⑶以前手性化合物如a-酮类为原料。图2是酶法制备D-型氨基酸的几种途径[1]。其中使用最多的是N-乙酰-氨基酰化酶和D-海因酶途径。
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3.酶法制备D-氨基酸
3.1氨基酰化酶法
氨基酰化酶法拆分手性氨基酸制备D-氨基酸的原理如图3[1]。
氨基酰化酶也有多个种类，各类氨基酰化酶的底物特异性各不相同，例如Aspartoacylase和acyl-lysine deacylase分别专一地对应于N-acetyl-L-aspartic acid和N-acetyl-L-lysine。Aminoacylase I对水解脂肪族L型N-酰基母氨基酸(N-acyl-α-amino acids)有较高的活性。而Aminoacylase III则更适合于水解芳香族(aromatic)L型的N-酰基氨基酸(N-acyl amino acids)。因此，不同氨基酰化酶可以拆分不同氨基酸。从文献报道来看，氨基酰化酶能够
拆分制备的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸等[1，4]。
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氨基酰化酶的来源很广，已经发现的氨基酰化酶广泛存在于各种动物和植物的器官中，以及微生物胞内或发酵液中。虽然有用动物肾脏氨基酰化酶拆分法制备某几种D-氨基酸的报道[5]，但是由于来源有限，提取纯化工艺复杂，成本高，不适用于大规模工业化分离，因而从微生物中提取的酶，尤其是米曲霉产生的米曲氨基酰化酶应用更为广泛。目前通过间歇反应器的试验数据处理，获得了米曲氨基酰化酶酶促反应的动力学参数，提出的模型能较好地描述固定化菌体连续拆分DL一丙氨酸的过程。[6]对于氨基酰化酶途径目前的研究集中在通过优化米曲霉菌培养条件、调节底物浓度、辅酶、pH、反应时间等反应条件等方法提高产品的产率和光学纯度。另外，游离的米曲氨基酰化酶不稳定，在4℃保存2 d即失活，因此对于米曲氨基酰化酶固定化也是目前对这一方法研究的重点。除了固定化酶意外，还有研究者利用了固定化细胞技术。固定化细胞是用物理或化学的方法使细胞与水不溶性大分子载体结合，或将细胞包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的，与游离细胞相比，固定化细胞不仅能保持酶催化的高效性，还能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性，有利于酶的循环使用并显著提高酶的使用效率。[7]
3.22海因酶法
海因酶法拆分手性氨基酸制备D-氨基酸的原理如图4[8]。未被选择性水解的L-5-取代海因可以自发消旋化，能够提高产率，并简化分离操作。
图4 酶法水解D-5-取代海因制备D-氨基酸过程示意图
不同的海因酶对D、L型取代海因的催化效率不同。目前的研究通过分析不同海因酶的氨基酸序列，确定了海因酶的活性中心，并且可以通过定向进化获得对D型或L型取代海因高度专一的海因酶。海因酶是金属离子依赖性的酶，研究表明微量的Co2+雅施达、Mn2+和Ni2+可以
明显提高海因酶活性，浓度过高的Co2+及Hg2+会抑制酶活。海因酶活性受金属离子影响也较明显，Cu2+、Ag+对酶有抑制作用。对Zn2+的作用存在争议，通过对体外纯化的海因酶研究表明Zn2+对酶活有轻微的抑制性，因为在1 mmol·L-1Zn2+浓度下，纯化的二聚体的酶解离为单体，从而引起酶活性的降低，但是通过向培养基中添加微量的锌离子却可以提高细胞海因酶的产量。[8]
海因酶应用的限制在于海因类化合物在水中溶解度低，消旋反应速率低。提高温度可以增加海因的可溶性和自消旋的速度，因此提高海因酶的耐热性十分重要。根据文献报道，目前在进行从嗜热菌中提取海因酶与氨基酰化酶、基因工程改造海因酶的研究。加入助溶剂、使用可能含有消旋酶的粗酶也是解决办法。[8，9]酶的固定化技术同样有提高海因酶稳定性和重复利用次数的作用。
4.展望
D-氨基酸有着广阔的应用前景，生物法制备反应条件温和，无需高温高压，底物转化率和光学活性都较高，但是生物法也有其弱点，如由于酶的活力和稳定性的问题，使投料浓度
和产物浓度都很低，由此而造成生产强度低，能耗大。因此，虽然关于酶法制备D-氨基酸已经进行了大量研究，离大规模工业化生产还有距离。解决这些问题的方法包括采用蛋白质工程、酶工程等手段提高酶的活性和稳定性，采用基因工程和定向进化等手段，解决酶的活性和稳定性等方面的问题。因此，有理由相信，随着研究的深入，手性氨基酸的生产水平会不断提高，不断为社会创造更多价值。
参考文献
[1]陈建波，徐毅，D-型氨基酸的生物法制备，《分子催化》，2006,20(3)
[2] 吴刘洋，《几种D-型氨基酸的制备研究》，东南大学硕士学位论文
[3] 蒋滢，徐颖，朱庚伯等，人类味觉与氨基酸味道，《化工进展》，2002，21(2)：103．105
[4]钟琦，《氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸》，浙江大学硕士学位论文
[5] 姚文兵，侯振清，吴梧桐，固定化牛肾氨基酰化酶拆分法制备D-丙氨酸，《中国药科大学学报》，2000(4)
[6]王燕，张凤宝，宋正孝，固定化米曲霉菌体填充床拆分DL-丙氨酸的动力学行为《过程工程学报》2002(2)
[7]熊吉滨，刘均忠，刘茜，焦庆才，固定化细胞酶法拆分N-乙酰-D,L-3-甲氧基丙氨酸，《高等学校化学学报》，2010年8期
[8] 董妍玲，谭新国，潘学武，海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展，《氨基酸和生物资源》，2009，31(3)
[9]毕洪书，沈飞，沈树宝，胡永红，欧阳平凯，海因酶法制备L-氨基酸研究进展，《精细与专用化学品》， 2002，10(22)
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