1 ALA （5–氨基酮戊酸）含量的测定（所有操作均在4℃下进行） 参照Dei（1985）的方法：用质量体积比为4%的三提取 0.5 g 叶片中的ALA，5 mL提取液与2.35 mL NaAc（1 mol·L-1）、0.15 mL乙酰丙酮和2.5 mL 醋酸盐缓冲液（1mol·L-1，pH 4.6）混合后，于沸水浴中加热10 min，冷却至室温后，用Ehrlich-Hg试剂显，检测波长553 nm处的OD值。
2 PBG（胆素原）含量的测定
氘灯
参照 Bogorad（1962）的方法：取0.5 g叶片用液氮研磨后，加入5 mL 提取缓冲液（0.6 mol·L-1Tris，0.1 mol·L奥林匹克大逆转-1EDTA，用盐酸调至pH 8.2）提取叶片PBG，104即时通信工具公众信息服务发展管理暂行规定×g离心10 min，取2 mL上清液加2 mL Ehrlich-Hg试剂，黑暗中显15 min，测波长553 nm处的OD值。 3 Urogen Ⅲ（尿卟啉原Ⅲ）含量的测定
80式通用机参照Bogorad（1962）的方法：取0.5 g叶片经 0.067 mol· L-1磷酸缓冲液（pH6.8）提取，
取5 mL提取液加入0.25 mL，溶液（1%），强光照射20 min后，用1 mol·L-1冰醋酸调pH至3.5。乙醚萃取3次，合并水相并测405.5 nm处的OD值。目击证人
叶绿素降解相关酶的测定
叶绿素—叶绿素酶—脱植基叶绿素—脱镁螯合酶—脱植基叶绿素酸—脱镁叶绿酸双氧酶—素丧失
1.1 剪碎后混合均匀，称取2 g，加入10 mL丙酮，在液氮中研磨后，置于-20℃提取40 min，提取液12000×g 离心5 min，去除上清液，对底部沉淀再用同样条件重复提取2 次。在沉淀中加入5 mM pH=7 的磷酸缓冲液3 mL（含50 mM KCL，0.24%TritonX-100），30℃下磁力搅拌30min，12000×g 离心5 min，上清液即是酶粗提液。
1.2 酶活性测定酶活性的测定参照Fang[10]、Fernandez-Lopez[11]等人的方法：反应体系包括0.1M抗坏血酸30μL，酶粗提液500μL，120μmol/L的叶绿素300ul，丙酮1.7mL，最 后加蒸馏水定容至3.3 mL。反应体系于35℃、黑暗条件下反应40min。然后加入预冷的丙酮3mL，正己烷6mL，剧烈震荡来终止反应。4℃，12000×g 条件下离心5min，取丙酮层，测定667nm下的OD值。以沸水浴加热失活的酶液为比空白对照。试验所用的叶绿素纯品购自Sigma公司。
2 MDCase的提取和测定
取叶片按照2ml/g的比例加入4摄氏度预冷的提取液【0.1mol/l的磷酸缓冲液ph=6含0.2%tritonX-100,30g/l聚乙烯吡咯烷酮，1mmol/l苯和5mmol/la半胱氨酸】，冰浴中匀浆后放在低温摇床上震荡2h后，4层纱布过滤，滤液在4摄氏度下以9000g离心20min，上清液为粗酶液。
花苷含量的测定及相关酶活性的测定医疗器械不良事件监测和再评价管理办法
花苷：是花素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜。花苷是类黄酮——以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红的一族化合物。
溶解性：溶于水；颜随着PH的改变而发生变化，酸性条件下为红，中性为紫，在碱性条件下呈蓝
1. 花苷含量的测定
参照Pirie 和Mullins（1976）的方法，取0.5 g 样品，加入10 mL 预冷的1%盐酸—甲醇溶液，避光室温浸提2 h。用分光光度计测定提取液在530 nm 和657 nm 处的吸光值，二者之差即为花青苷的相对含量。差值每增加0.01 定义为一个单位U。设取样重复3 ~ 5次。
2 叶片中PAL(苯丙氨酸解氨酶）活性的测定
取0.5g剪碎的叶片加入5ml提取液[0.05molL-1Na2HPO4/KH2PO4(pH7.0)，
0.05mol.L-1抗坏血酸，0.018mol.L-1巯基乙醇]，冰浴匀浆，4℃下15000g离心20min，上清液为酶粗提液，用于测定酶活性。PAL和CHI活性测定参照Lister等的方法。
PAL活性 取4支10ml试管(3支测定管,1支对照管),分别加入0.02mol/l L-苯丙氨酸1.0ml(对照管不加,代之为蒸馏水),硼酸缓冲液(Ph=8.8)2.0ml,酶液1.0ml(根据酶活性适当的稀释或增加
体积),总体积4.0ml.摇匀后置30℃恒温水浴中保温60min,加0.2ml 6mol/lHcl终止反应hyu,若有沉淀需过滤或离心.用对照tiu管调零,在290nm处检测测定管反应液得吸光度A290。
以测定管反应液每小时A290增加0.01为一个酶活性单位(u)
PAL活性(u/gFw.h)= A290×Vt×v/0.01×VS×Fw×t
式中：Vt:酶液总体积(ml); Fw:样品鲜重(g); VS:测定时取酶液的量(ml); v:反应液总体积(ml); t:反应时间(h)。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议