Ⅱ-Ⅺ A抗生素微生物检定法
本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。 成人博客
第一法：管碟法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 菌悬液的制备
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液：取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液：取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液：取金黄葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液：取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液：取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液：取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。
肺炎克雷伯氏菌（Klebosiella Pneumoniae）悬液：取肺炎克雷伯氏菌[CMCC（B）46117]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
支气管炎博德特菌（Bordetella Bronchiseptica）悬液：取支气管炎博德特菌［CMCC（B）58403］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在32～35℃培养24小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
标准品溶液的制备：标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
供试品溶液的制备：精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再
按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。
双碟的制备：取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（照表1）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外径7.8mm±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。
检定法
二剂量法：取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2:1或4:1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法（附录Ⅱ-ⅩⅣ）中的（2.2）法进行可靠性测验及效价计算。足菌肿
三剂量法：取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度（S3）、中浓度（S2）及低浓度（S1）的标准品溶液，其余3个小管分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液；三种浓度的剂距为1∶0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法（附录Ⅱ-ⅩⅣ）中的（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
第二法：浊度法
本法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液制备
金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液：取金黄葡萄球菌［CMCC（B）26 003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液：取大肠杆菌［CMCC（B）44 103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
白念株菌（Candida albicans）悬液：取白念株菌［CMCC（F）98 001］的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于10mlⅨ号培养基中，置35～37℃培养8小时，再用Ⅸ号培养基稀释至适宜浓度，备用。
标准品溶液的制备：标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表3的规定进行稀释。
松香甘油酯标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
供试品溶液的制备：精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表3的规定稀释至标准品相当的程度。
含试验菌液体培养基的制备：临用前，取规定的试验菌悬液适量（35～37℃培养3～4小时后测定的吸光值在0.3～0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加
入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。
已接种试验菌的液体
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2.回归系数的显著性测验
判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。
假设H0：b=0，在假设H0成立的条件下，按下图公式（4）～（6）计算t值。
其可信限率除另有规定外，应不大于5%。
3.4供试品含量的计算：将计算得到的抗生素浓度（将1g值转换为浓度）再乘以供试品的稀释度，即得供试品中抗生素的量。
二剂量法或三剂量法：除另有规定外，取大小一致的已灭菌的试管，在各品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择适宜的高、（中、）低浓度，分别精密加入各浓度的标准品和
供试品溶液1.0ml，二剂量的剂距为2：1或4：1，三剂量的剂距为1：0.8。同标准曲线法操作，每一浓度组不少于4个试管，按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。照生物检定统计法（附录Ⅱ-ⅩⅣ）中的（2.2）法和（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
培养基及其制备方法
培养基I
胨5g；琼脂15～20g；牛肉浸出粉3g；水1000ml；磷酸氢二钾3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ
胨6g；葡萄糖1g；牛肉浸出粉1.5g；琼脂15～20g；酵母浸出粉6g；水1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ
胨5g；磷酸氢二钾3.68g；牛肉浸出粉1.5g；磷酸二氢钾1.32g；酵母浸出粉3g；葡萄糖1g；氯化钠3.5g；水1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅳ
胨10g；葡萄糖10g；氯化钠10g；琼脂20～30g；枸橼酸钠10g；水1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅴ
胨10g；琼脂15～20g；麦芽糖40g；水1000ml
除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基Ⅵ
胨8g；磷酸二氢钾1g；牛肉浸出粉3g；葡萄糖2.5g；酵母浸出粉5g；琼脂15～20g；氯化钠45g；水1000ml；磷酸氢二钾3.3g
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅶ
胨5g；枸橼酸钠10g；牛肉浸出粉3g；琼脂15～20g；磷酸氢二钾7g；水1000ml；磷酸二氢钾3g
西南联合大学
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
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